Способ приготовления бумажной индикаторной полоски для определения дезаминаз бактерий

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Реслублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву(22) ЗаЯвлено 0709.79 (21) 2821177/28-13 (53) M. КЛ.З

С 12 Я 1/00

G 01 N 33/ 18 с присоединением заявки ¹â€”

Государственный комитет

СССР

II0 делам изобретений и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 230982. Бюллетень ¹ 35

t5 lУДК 543.866 (088. 8) Дата опубликования описания 2309.82

1 (72) Авторы изобретения гицжЕСО(ЯЗЫЯ

A.Ï.Êàëàí÷à, В.N.Íèêèòèí и Ф.И.Гео

1 ПЛТЕ1Чтц0- 2 1%

П . т 1:11 о 1 g

1д (7! ) Заявитель (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БУМАЖНОЙ ИНДИКАТОРНОЙ ПОЛОСКИ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗАМИНАЗ БАКТЕРИЯ

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения реагента для определения дезаминаз у бактерий.

Известен способ приготовления индикаторных бумажных полосок для определения фенилаланиндезаминазы бактерий путем нанесения на хроматографическую бумагу фенилаланина и лимонноаммиачного железа (коричневого), растворенных в воде при 100оС, пропитывания хроматографической бумаги, высушивания ее при 50-60 С, нанесения на нее 10%-ного водного раствора поливинилового спирта в виде пленки с последующим повторным высушиванием бумаги при 50-60 С и раэрезанием ее на полоски шириною в 1 см. Фенилаланиндезаминазу определяют путем нанесения исследуемой бактериальной культуры в виде "бляшки" на поверхность индикаторной бумажки. Результаты реакции учитывают через 1015 мин. Срок годности бумажек 6 мес.

При дальнейшем хранении имеет место изменение цвета индикаторных бумажных полосок(13.

К недостаткам известного способа следует отнести относительно сложный многоэтапный процесс приготовления индикаторных полосок, ограниченный срок годности, а также недостаточную экономичность, связанную с тем, что большая часть .аминокислоты, импрегнированной в поры впитывающей бумаги, остается неиспользованной.

Кроме того, импрегнированная реагентами хроматографическая бумага при высушивании коробится, полости бумаги скручиваются. Дезаминазы опоеделяются непостоянно. в положительных случаях реакция проявляется слабо и с большим опозданием при условии инкубации полосок во влажной каме15 ре.

Целью изобретения является упрощение. ускорение способа и увеличение срока годности индикаторной полоски.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления бумажной индикаторной полоски для определения дезаминаз бактерий, вклю чающему нанесение на поверхность бумажного носителя аминокислоты, поливинилового спирта и железосодержаще.го реактива с последующим высушиванием. в качестве бумажного носителя используют бумагу ватман, в ка,честве железосодержащего реактйва—

960262.6И О, т.е. соль Мо- растворы реагентов приобРетают спора, указанные р нные реактивы используют в . собность частично и неравномерно виде водного раствора аствора их смеси и впитываться бумагой и их концентнанесение их на о носитель осуществ- рация, в каплях становится неодииако,пяют в виде капель, ель а высушива- вой и непостоянной, а капли расплысуществляют при 18-25 С. Ъ ваются на бумаге. ние осущес

При этом о ыч

П т м обычно при реализации в вне

При нанесении реагентов д б способа для нанесе б я нанесения используют маленьких точек на поверхность у-, водны раство и твор аминокислоты LFeSOg x маги ватман и последующем взаимо(gH ) 9Q 6Н 0) и поливинилового действии их с микробной культурой ноержащий данные компоненты fo имеет место полная утилизация ами соответственно в следующих количест- кислоты, тогда как по известному вах, г 10+0,1, 540,1 и 10 0,1 на . способу основная часть аминокислоты остается неиспользованной бактерия1 л воды.

Применение соли Мора в предлагае- ми. мом способе для определения дезаминаз g Способ осуществляют следующим оббактерий позволяет получить реагент, разом. который не изменяет свои п н ет свои первоначаль- Поливиниловый спирт растворяют ные свойства в течение чение 3 лет (срок совместно с аминокислотой в дистило наблюдения) и следов

) следовательно, поэво- лированной воде при 90-100 С, оха ляет более достоверно с оверно судить о про-. лаждают при 15-25 С, добавляют и раст26 цессе дезаминирования. . воряют соль Мора. Полученный растИспользование плотно е плотной невпиты- вор наносят на поверхность бумаги

006вающей бумаги ватм и б и (ватман) позволяет на- ватман, в виде капель объемом 0. носить реагирующие ющие субстраты в .микро- 0.007 мл,которые высушивают при количествах на ограниче граниченной площади 18-25 С. Для осуществления способа анных капель Тем аминокислоту. поливинйловый спирт самым расширяется круг круг изучаемых ами- и соль Мора применяют в концентра1В нокислот, создается вдается достаточная их . циях соответственно 1i0,5 и концентрация и в то же в же время снижается Носитель представляет собой пласиентов поскольку йсклю- тинку иэ плотной невпитывающей .бучается возможность пр можность пропитывания и ЗО маги ватман прямоугольной формы раздиффуэии реагентов в ентов в бумагу.. ;П Ф . . мером 7,5х5,5 см, соответствующую этом создается воэмож воэможность для более. - параметрам чашки Петри. Поверхность быстрого растворе астворения и контакта . носителя. расчерчена на 28 квадратов

Л субстрата с бактериями, нанесенными площадью 1 см. В центр каждого непосредственно на нн на субстрат Поли- 35 квадрата наносят по капле полученвиниловый спирт фиксирует микроко- ного реагента и пластинки оставличества ингредие диентов к поверхности ляют при комнатной температуре до вает их между собой, ис- полного их высыхания. Высохшие бумаги; связывает и ключает крошение в ошение высохших капель и капли имеют светло-коричневый цвет. предохраняет их от разрушения при 4р 1 отовые пластинки хранят при ком длительном хранении. натной температуре в сухом месте

Согласно предлаг н предлагаемому ппособу, На чертеЖе приведен образец пос б где реагенты наносят н сят на поверхность лучаемого по предлагаемому спосо у невпитывающей бумаги ватман, имеет . Реагента.

45 Схема образца реагента включает астворение. в воде, ж ейся в микробной культуре, цифровые обозначения 1-14 изучаемых соответственно быстрый контакт и соатветстве но р культур бактерий, бумажный носик обов с еагентами, что приводи ско ению еакции дезаминирования тель 15, квадрат 16, высушенные кап- ли 17, содержащие реагент для опре(езультаты учи р 5Q деления дезаминаз у бактерий. Реальтаты читываются через 23 мин).

По известноьг же способу Учет гент Ф, содержащий фенилаланин, . Реагент Т, содержащий триптофан. е аминирования возможен

П Р и м е о. Иэ листа 6 маги лько через 10-15 мин, так как только через оматографическая бумага. впитываю- ватман вырезают прямоугольную

55 пластинку размером 7,5 х 5,5 см о . содержащуюся в бактериаль- (15). расчерчивают на ее поверхносльтуре замедляет растворение ти прямоугольник площадью 7,0х4,0 см, реагентов. Кроме того, импрегнированные в поры ума бумаги реагенты мед- раэделяют. его на 28 квадратов (16) ленно диффундируют через ее толщу площадью 1 см. Каждый горизонтальный

- и защитную п защитную пленку иэ поливинилового 60 ряд квадратов обозначают справа спирта и позднее приходят в контакт первоначальной буквой названий аминокислоты (Ф или Т), а над и под

Высушивание капель проводят толь- каждым вертикальным рядом квадратов ко при комнатной температуре, так обозначают номер изучаемой микробкак при более высоких температурах 65 ной культуры (1-14).

960262

Число положительных результатов и интенсивность реакции

Абсолютное число штамMOB

Интервалы наблюдений

1 " 1

1 мес.

6 мес

48

48

1,5 г

42

33

2,5 r

39

3 r

П р и м е ч а н и е. Интенсивность оеакции: + - слабоположительная, ++ — положительная, +++ — резкоположительная.

В пробирку или колбу берут навеску 100 мг порошка аминокислоты и

50 мг поливинилового спирта,. затем добавляют 10 мл дистиллированной воды и растворяют ингредиенты над пла- менем спиртовки или на водяной бане при .9 0-10 0 С . Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, после чего вносят 100 мг соли Мора

tFeS04 - (NH4)4 S04-. 6H<0 3, которую растворяют при легком встряхивании пробир-10 ки" при 15-25 С. Приготовленный раст вор наносят по одной капле объемом .0 006-0,007 мл с помощью пастеровской пипетки с тонко оттянутым капилляроМ: в центр каждого квадрата, сост- 15 ветствующего обозначению аминокислоты. Например, в квадраты горизонтального ряда Ф наносят капли, содержащие фенилаланин, в квадраты горизонтального ряда Т вЂ” трипто- 20 фан и т.д. После этого пластинки оставляют .при комнатной температуре на 4-6 ч до полного высыхания капель (17) .

Готовые пластинки хранят при комнатной температуре в сухом месте . в картонных коробках или полиэтиленовых мешочках в течение 3 лет (срок наблюдения) (таблица).

Результаты реакции дезаминирования аминокислот бактериями родов

Proteus-Providenc1а в. зависимости от сроков хранения реагента представлены в таблице.

По мере надобности пластинки используют для определения дезаминаз у бактерий. С этой целью пластинку помещают в чистую чашку Петри для исключения случайного заражения окружающих предметов. Затем полную бактериальную петлю иэу- 40 чаемой культуры, снятую со скоше-. ного агара, наносят на поверхность высушенной капли с реагентом. При наличии соответствующей дезаминазы у микробов через 1-3 мин нанесенная культура и реагент окрашивают в цвет от темно-зеленого до черного. При отсутствии соответствующей дезаминазы культура и реагент не изменяют свою свою первоначальную окраску (светло-коричневый цвет) . Использованную часть пластинки отрезают, а оставшуюся часть сохраняют в той же чашке Петри для дальнейших исследований.

В приведенном примере реагенты, содержащие аминокислоты фенилаланин и триптофан„ могут найти применение в дифференциации бактерий кишечного семейства. В состав этого семейства входят бактерии группы

Proteus-Providencia, которые в отличие от остальных групп микробов данного семейства характеризуются . наличием фенилаланин- и триптофандезаминаэ. В пределах одной системы в течение 1-3 мин может быть определено отношение к фенилаланину и триптофану 14 бактериальных культур.

Технико-экономическая эффектив-! ность изобретения состоит в упрощении и ускорении способа, увеличении срока годности получаемой индикаторной полоски, а также снижении . расхода реактивов.

По известному способу 1 г аминокислоты расходуется на проведение

2800 исследований, тогда как согласно предлагаемому 1 г аминокислоты достаточен для проведения более

15000 исследований,т.е. достигается зкономический эффект более чем в 5 3 раза.

960262

Формула изобретения

Составитель О.Скородумова

Техред М. Гергель Корректор Е. Рошко

Редактор Л.Лукач

7149/31 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ приготовления бумажной индикатооной полоски для определения дезаминаэ бактерий,предусматривающйй нанесение на бумажный носитель аминокислоты, железосодержащего реактива и поливинилового спирта с последующим высушиванием, о т— л и ч а ю шийся тем, что. с целью упрощения и ускорения способа а также увеличения срока годности получаемой индикаторной полоски, в качестве бумажного носителя используют бумагу ватман, в качестве железосодержащего реактива— (ЕеБОф ХИ ) SO< 6Н О, указанные реактивы используют в виде водного раствора их смеси, наносят его на бумажный носитель . в виде капель . а высушивание осуществляют при

18-25" С.

2. Способ по п.1. о т л и ч а юшийся тем. что. используют водный раствор аминокислоты, TFeSOg x х (NHg)< $0 ° 6Н б и поливинилового спирта, содержащий данные компоненты в следующих количествах соот1О ветственно, г: 10+0,1; 510,1 и

10+0,1 на 1 л воды..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

15 1. Инфекционные забблевания у детей. Кишинев, "Штиинца", 1978, с. 17-18.