Способ определения барбитуратов в биологических жидкостях

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских, Социалистических

Республик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополкительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 080581 (21) 3285448/28-13 (5 Ф 3 М. Кл. з

G 01 N 33/48

I с присоединением заявки Nо—

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н,открытий (23) Приоритет

Опубликовано 071032. Бюллетень ¹ 37 (S3) УДК d616. 07 (088. 8) Дата опубликования описания 071082 (72) Авторы изобретения

А-А Ко"аев О.Д Протасова и Н и )кот ---ЗН„,, ЛЕЖНИ» "

Центральный ордена Ленина институт усовевшенср@уу врачей (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАРБИТУРАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЯХ

Изобретение относится к медицине, а.именно к способам диагностики острых отравлений.

Известен способ определения барбитуратов в биологических жидкостях путем их выделения, очистки и резкстрации целевого продукта с последующим,спектрофотометрированием пробы f1), Однако использование известного способа связано со значительными цо терями барбитуратов, использованием специальной дорогостоящей сублимаци-. онной и вакуумсублимационной аппара» туры и значительными затратами времени (только на операцию очистки— от 24 ч до 40 мин) наряду с другими операциями в методике определения, что снижает точность получаемых результатов и затрудняет применение способа в условиях лабораторий цент ров по лечению отравлений.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения барбитуратов в биологических жидкостях путем их выделения, очистки и реэкстрации целевого продукта с последунЫим спектрофотометрированием пробы., биологическую жидкость предварительно инкубируют с оливковым маслом в течение 1-1,5 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Перед изолированием препаратов проводят очистку путем инкубации с оливковым маслом в течение 1 мин встряхиванием в пробирке. После этого проводят определение барбитуратов.

В пробирку помещают плазму больного (0,5-1,5 мл), затем добавляют оливковое масло в количестве 1 .мп и встряхивают щюбирку в течение 1 мин. Для

15 разделения полученной смеси оливкового масла и плазма пробы центрифугируют в течение 1 мин при 3001000 об., после чего проводят забор плазмы для дальнейшего исследования.

Следующей стадиеи определения является извлечение препарата из биологической жидкости. В две пробирки, с притертыми пробками на 10-20 мп наливают по 8 мп хлороформа. В,одну из них переносят 1 мп плазмы, очищенной маслом. В другую — такой же объем стандартного раствора барбитурата, разведенного 0,1 н. раствором NaOH до предполагаемой концентрации. Затем содержимое пробирок подкисляют кон964532 центрированной соляной кислотой (О, б мл Н С В на О, 5 водной фазы), Далее добавляют сернокислый безводный натрий до полного связывания водной фазы (3-4 r и более). Содер жимое пробирок энергично встряхива- 5 ют в течение 1 мин. Затем проводят реэкстракцию и очистку, для чего хлороформные вытяжки отфильтровывают и берут по б мл в две пробирки с притертыми пробками. Туда же добавляют по 4 мп 0,1 н. раствора NaOH.Пробирки энергично встряхивают в течение 1 мин, после чего проводят спектрофотометрические измерения.

Для быстрого разделения слоев пробы центрифугируют при, 3000-5000 об/мин в течение 10 мин. Осторожно, не нарушая границы раздела двух слоев, пипеткой отбирают по 3 мл верхнего щелочного слоя из каждой пробирки и переносят в прямоугольные кварцевые кюветы с толщиной слоя 10 мм. В контрольную кювету наливают 3 мл 0,1 н. раствора йаОН.Во всех трех кюветах с опытным, стандартным и контрольным растворами рН был равен 13,0.

Определяют величины оптической плотности при следующих длинах волн: 228, 232., 235, 240, 247, 249, .252, 260 и

270 мкм без светофильтра с водородной лампой и сурмяноцезиевым фото- 30 элементам против контрольного раствора. Добавляют в кюветы, в.ключая контрольную, по 0,44 мл боратного раствора. При этом рН становится равной 10,0. Снова определяют оптичес- 35 кую плотность при тех же длинах волн. Объем добавленного баратного, раствора может быть иным. Содержание барбитуратов вычисляют по разнице оптической плотности при рН 40

13,0 и 10,0 и и 260 мкм. !

Пример. На исследование были взяты пробы крови больного, отравленного люминалом, и донорская кровь| 45 экспериментально затравленная вероналом и нембуталом. Пробы крови центрифугируют для получения плазмы. Затем в первую пробирку помещают по 2 мл плазмы, затравленной вероналом, во вторую - затравленной нембуталом, в третью — йлазму больйого,отравленного люминалом.Для очистки плазмы ат сопро" вождакацих веществ, мешающих определению, во все пробирки добавляют по

1-1,5 мл оливкового масла. Встряхиванием в течение 1 мин проводят инкубацию плазмы .с оливковым маслом.

Затем пробы центрифугируют в течение 1 мин при 1000 об/мин. Следующим этапом проводят изолирование верона- 60 ла, нембутала и люминала. В шесть пробирок на 10-20 мл наливают по

8 мл хлороформа, в три из них переносят по 1 мл плазмы из первой, второй и третьей пробирок. В три другиетакой же объем стандартного раствора вербнала, нембутала и люминала, разведенных 0,1 н, раствором йаОН до предполагаемой концентрации. Затем содержимое пробирок подкисляют концентрированной соляной кислотой. Далее добавляют сернокислый безводный натрий до полного связывания водной фазы. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 1 мин. Затем проводят очистку и реэкстракцию.

Хлороформные вытяжки отфильтровывают и берут по б мл в шесть пробирок с притертыми пробками, Туда же добавляют по 4 мл 0,1 н. раствора NaOH.

Пробирки энергично встряхивают в течение 1 мин. После чего проводят спектрофотометрические измерения.

Предварительно пробы центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 10 мин.

Затем пипеткой отбирают по 3 мл верхнего слоя поочередно из каждой про бирки и переносят в кварцевые кюветы спектрофотометра. Измерения проводят в три этапа. Первый этап исследуются пробы с вероналом, стандартным раствором веронала, второй этап — пробы. с нембуталом, стандартным раствором нембутала, третий этап — пробы с люминалом, стандартным раствором люминала. В контрольные кюветы во всех трех этапах наливают по 3 мл 0,1 н. раствора NaOH.

Определяют величины оптических плотностей при длинах: 228, 232, 235, 240, 247, 249, 252, 260 и 270 мкм сначала при рН 13,0. Затем добавив по 0,44 мл боратного раствора во все кюветы, включая и контрольные, измеряют оптическую плотность при рН 10,0. После проведения исследования содержание экстрактивных веществ, мешающих спектрофотометрическим измерениям, резко снижается. Это приводит к получению кривой спектра поглощения исследуемого барбитурата к эдентичному соответствию кривой спектра поглощения "чистых растворов", растворов барбитуратов в воде.

Предложенный способ является"бдлее точным, позволяет в результате однократного исследования, обеспечи вающего практически полное отсутствие веществ, мешающих определению, получить классическую барбитуровую кривую, позволяющую дать качественную и количественную оценку содержания препарата в крови. Кроме того, получение классической точной кривой спектра барбитуратов позволяет в ряде случаев устранить. операцию качественного определения при установлении принадлежности неизвестного вещества к классу барбитуратов.

Формф а,изобретения

Способ определения барбитуратов в биологических. жидкостях путем их

964532

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.. Составитель Ю.Алмазов

Редактор O.Юрковецкая Техред.М.Гергель Корректор;А.Гриценко

Ю Ю Ю Ю 4В

Заказ 7620/24 Мираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 выделения, очистки и реэкстракдии целевого продукта с лоследуюшим спектрофотометрированием пробы, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, биологическую жидкость предварительйо инкубируют с оливковым маслом в течение 1-1,5 мин.

1. Кокшарова Н.В. Хроматография в тонком слое как метод определения барбитуратов при химико-токсикологических исследованиях. М., "Медицина",,1966,,с. 3.