Способ определения концентрации микроорганизмов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (ii)973610 (6! ) .Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.05.81 (2! ) 3294236/28 13 с присоединением заявки № (23) Приоритет— (51)М. Кл.

С 12 N 1/ООЦ

С 12 Q 1/06

Гоеудзрстеенный комитет

СССР

Опубликовано 15.11.82. Бюллетень №42

Дата опубликования описания 15.11.82 по делаи изобретений и открытий (53) УДК 579.083. .1 (088.8) В. Д. Лысов, И, В. Цибанова, А. Н. Мезенцев,,Т. В. Жижина, В. Л. Земляков, К. М. Субботина и В. Х. Тихрнов

k

1 (Всесоюзный научно-исследовательский институт- -биологического приборостроения (72) Авторы изобретения (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ!

Изобретение относится к микробиологии, .. в частности к способам определения концентрации микроорганизмов.

Известен способ определения концентрации микроорганизмов, включающий регистрацию хемилюминесценции, возникающей при разложении перекиси водорода ферментом каталаза в присутствии хемилюминесцентного состава (1).

Недостатком способа является его огра-1О ниченная применимость, так как не все микроорганизмы содержат каталаэу.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения концентрации

15 микроорганизмов, предусматривающии приготовление(суспензии микроорганизмов в водной среде, окисление клеточных структур марганцевокислым калием и регистрацию кинетики хемилюминесценции. Согласно этому способу к анализируемой суспензии микроорганизмов в дистиллированной воде добавляют раствор марганцевокислого калия. При окислении марганцевокислым калием белков

2 клеточных оболочек бактерий возникает хемнлюминесценция, по кинетике которой можно различать живые и мертвые бактеФ рии. Для мертвых микроорганизмов с момента введения окислителя интенсивность хемилюминесценции во время растет, достигает максимального значения и относительно медленно уменьшается. Для живых микроорганизмов интенсивность хемилюмннесценции возрастает, проходит через максимальное значение, уменьшается, затем снова возрастает, проходит через второе максимальное значение и далее снова уменьшается.

На фиг. 1 представлены кинетические хемилюмннесцентные кривые живых и меутвых микроорганизмов Candida guillermonolii суспендированных в дистиллированной воде.

Окислитель 0,1% КМп04 + 1,8 М ВаС!з.

Концентрация Candida gui I lermondii 2 ° 10 кл./

/проба. Стрелкой обозначено время ввода окислителя. Кривая 1 — Candida guilfermon—

d11, убитые кипячением, кривая 2 — суспензия, содержащая! 98% живых клеток. По оси ординат интенсивность хемилюминесцен973610

3 ции, отн. ед., масштаб кривой 1. составляет

1:10 от масштаба 2, по оси абсцисс время, с.

Интенсивность хемилюминесценции в обоих случаях прямо пропорциональна концентрации микроорганизмов.

Для суспензий, содержащих одновременно: живые и мертвые бактерии, интенсивность

1 первого максимума 3 меньше, чем для мертвых бактерий и выше, чем для живых, а интенсивность второго максимума 3< меньше, чем для живых, Отношение интенсив- >, костей 3 /3 уменьшается с уменьшением от. носительйого содержания живых бактерий, т.е. величина 3 > / 3 характеризует относительное содержание живых бактерий в анализируемой суспензии, а значения 3< и

3 — концентрацию микроорганизмов (2) .

Недостатком способа является небольшая точность определения концентрации и относительного содержания живых микроорганизмов, связанные с невысокой чувствительностью способа для живых бактерий по сравнению с мертвыми, вследствие дестабилизации мембранных белков живых клеток в дистиллированной воде. Величина интенсивности второго максимума на кинетической кривой хемилюминесценции, зарегистрированной для живых микроорганизмов (фиг. 1, крио вая 2), незначительно превышает величину интенсивности на кривой хемилюминесценции мертвых микроорганизмов при времени, соответствующем второму максимуму хемилюминесценции живых бактерий. Вследствие этого в диапазоне относительного содержания живых микроорганизмов рт 0 до 50% концентрацию живых микроорганизмов практически невозможно определить.

Целью изобретения является повышение точности определения концентрации клеток и относительного содержания живых мйкроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации микроорганизмов, предусматривающему приготовление суспензии микроорганйэмов в водной среде, окисление клеточных структур марганцевокислым калием и регистрацию кинетики хемилюминесценции, перед окислением клеточных структур добавляют в водную среду днгидрофосфат калия до достижении рН 4,0 — 4,7 и выдерживать в течение

2-10 мин.

Способ основан на стабилизации клеточных оболочек живых микроорганизмов ионами водорода и на смещении равновесия между окислитсльными состояниями марганца в сторону ионов трехвалентного марганца при помощи ионов водорода и фосфата, В резулыате взаимодействия мембран и клеS

4 точных оболочек живых клеток с ионами водорода, образующимися при диссоциации дигидрофосфата калия, структурные единицы мембран увеличивают устойчивость, При взаимодействии марганцевокислого калия с живыми клетками второй максимум хемилюминесценции обусловлен реакцией ионов марганца с реактивными белковыми группами, экспонированными внутрь клетки. Доступность реактивных групп зависит от скорости проникновения ионов марганца в клетку и от скорости разрушения оболочек клеток окислителем, происходящего одновременно с хемилюминесцентной реакцией. При стабилизации мембранных белков скорость разрушения клеточной оболочки марганцевокислым калием уменьшается, а количество неразрушенных клеток увеличивается. В результате этого к моменту появления второго максимума количество реагирующих с ионами марганца белковых групп больше, чем в случае нестабилиэированных мембран, что и приводит к увеличению интенсивности второго максимума хемилюминесцснтной кинетической кривой.

Введение дигидрофосфата калия в контакт с. марганцевокислым калием препятствует образованию двуокиси марганца, образующейся в нейтральной среде и выводящей ионы марганца из реакции. Вследствие этого увеличивается степень превращения перманганат-аниона в ионы трехвалентного марганца, участвующие в процессе излучении энергии. Увеличение концентрации ионов IVln вызывает увеличение скорости реакции окисления и, соответственно, скорости спада интенсивности хемилюминесценции мертвых микроорганизмов, что обеспечивает уменьшение отношения 3 2 / 3 для мертвых бактерий по сравнению с нейтральной средой и увеличение различия значений 3 < /Л„живых и мертвых микроорганизмов.

На фиг. 2 представлены зависимости интенсивности второго максимума хемилюминесценции 32 (кривая 1), отношения интенсивностей второго и первого максимумов 3r2 /3g (кривая 2) суспснзии М сгосос—

cus glut8micus и интенсивности фонового свечения среды инкубации 3 (кривая 3) от рН. Кислотность среды варьируют введением дигидрофосфата калия различной концентрации. Концентрация M icrococcus 10 кл./

/проба (95% живых клеток), время инкубации

10 мин. Условия окисления те же, что и на фиг. 1. По оси ординат 32, 32 /3 и 3, в относительных единицах, по оси абсцисс рН среды инкубации. Интенсивность 3 2 при рН 7 принята за единицу.

973610 (3 2/31 А) 100 — В+3 /3„, (g>

C = K(32- A3„) 5

Иэ данных фиг. 2, видно, что введение дигидрофосфата калия до рН 4,7 — 4,0 в суспенэию микроорганизмов приводит к увеличению интенсивности второго максимума хемилюминесценции 3 2 и отношения Э 2 g .„.

Дальнейшее уменьшение рН, помимо увеличения интенсивности g и отношения 3 2/3

1 приводит к резкому возрастанию интенсйвности фонового свечения среды инкубации

Зф (кривая 3 на фиг. 2), что увеличива- 1О . ет погрешность определения величин 3g и

3,2 / 3„В .таком случае оптимальными значениями рН среды инкубации являются 4,7—

4,0, при которых способ позволяет определять концентрацию микроорганизмов в диа- тэ назоне относительного содержания живых клеток от 20 до 100%.

Время прединкубации суспензии микро организмов с дигидрофосфатом калия должно составлять не менее 2 мин, поскольку, на- 20 чиная с, этого момента, отношение интенсивностей 3< /3 становится максимальным и не меняется при увеличении времени прединкубации, На фиг. 3 представлена зависимость отно- 2$ щения интенсивностей второго и первого максимума хемилюминесцентной кинетической кривой 32 /3 суспенэии Micrococcus glutomi1

cus от времени инкубации с 0,05 М дигидрофосфатом калия (pH 4,63). Концентрация З0

Micrococcus 1 10 кл,/проба (95% живых клеток). Условия окисления те же, что на фиг. 1. По оси ординат 32 /3„, по оси абс.цисс время инкубации, мин.

Способ осуществляют следующим образом.

К 0,5 мл суспензии Candida guillermondii добавляют 0,5 мл 0,1 М дигидрофосфата калия (рН смеси 4,63) и выдерживают 2 мин при комнатной температуре. Отбирают 0,2 мл в кварцевую кювету и помешают в кюветное отделение установки для регистрации кинетики хемилюминесценции. Вводят в кювету

0,2 мл раствора окислителя (0,1% КМп04 +

+ 1,8 М BaClz) и одновременно начинают регистрировать кинетику хемилюминесцентной реакции. После проведения реакции по хемилюминесцентной кинетической кривой определяют значения интенсивностей первого и второго

MaKcH MoB (3 1 H 3 g cooTBeTCTBeHHO) .

Концентрацию живых микроорганизмов опре50 деляют по эмпирической формуле где С вЂ” концентрация живых микроорганизмов;

Я

А — значение отношения интенсивностей второго и первого максимумов хемилюминесценции 3 /3„, определен6 ное для Candida guillermondii, убитых кипячением (поскольку второй максимум на кинетической кривой мертвых клеток отсутствует; в качестве Э используется значение интенсивности хемилюминесценции при времени второго максимума живых клеток.

К определяется по калибровочной кривой, описывающей интенсивности суспензий с известной концентрацией живых клеток.

Относительное содержание живых клеток (х) определяют путем расчета отношения зарегистрированных интенсивностей второго и первого максимумов хемилюминесценции

ho эмпирической формуле следующего вида

2 / 1

Х вЂ” — — — —.100%, (Я) 13 /3

1де А — определяется так же, как и в формуле (1);

В, Π— постоянные, рассчитанные экспериментально из опытов с использованием суспензий с известным относительным содержанием живых клеток после преобразования формулы (2) в линейное уравнение подставляя в уравнение (3) значения 3 /31 для двух суспензий с разным извсстным относительным содержанием живых клеток, определяют значения В и D.

Для суспенэии Candida guillermondii npH рН 4,63 значения А, В и D,ñîñòàâëÿþò 0,068, 0,0064 и 0,993 соответственно.

Сравнивают результаты по измерению концентрации и относительного содержания живых клеток в суспензии Candida guillermondii известным и предлагаемым способами. Контроль концентрации живых микроорганизмов осуществляют путем высова пробы на чашки

Петри с питательной средой и подсчета выросших колоний. Относительное содержание живых микроорганизмов измеряют путем подсчета общей концентрации клеток в камере

Горяева с последующим делением числа жизнеспособных клеток на их общее количество.

Результаты экспериментов приведены в таблице.

Как видно из таблицы, при относительном содержании живых клеток менее 50%, когда известный способ не позволяет точно определять концентрацию и относительное содержание живых микроорганизмов, введение в водную среду дигидрофосфата калия обес973610 печивает определение относительного содержания живых клеток с точностью до 4%, а концентрации живых клеток с точностью до

10 o. При относительном содержании живых микроорганизмов свыше 50% предлагаемый спо- f соб дает точность для относительного содержания в 1,5 раза выше, чем известный способ, для концентрации живых микроорганизмов точность в 2,5 раза выше.

Таким образом, использование предлагаемогс, способа определения концентрации микрооргаИзвестный Контроль

) способ

1,6, 106 30,3

Концентрация живых микроорганизмов, кл/мл суспензии

Предлагаемый способ

0,2

2 5 10е

25,0

45,7

1,0-10

5,2. 109

5,1 109

86,3

80,8

91,2

88,3

97,1

97,4

Формула изобретения

Способ определения концентрации микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов Ь водной среде, окисление клеточных структур марган сцевокислым калием и регистрацию кинетики хемилюминесценции, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения концентрации клеток и относительного содержания живых микроорганйзмов, перед окислением клеточных структур

1,6 10в

8,1..108

1,6 ° 10

3,5 109

68 10

1,5 10е

9,2.10е

1,8 ° lpe

3,2 10

7,0 ° 10а ниэмов по сравнению с известными способами позволяет в одном эксперименте одновременно определять концентрацию и относительное содерМание живых микроорганизмов в диапазоне

Ьтносительного содержания от 20 до 100% с

{точйостью определения относительного содержания в диапазоне от 20 до 70% не выше 4%, а в диана.оне от 70 до 100 не выше 1%, что особенно важно при контроле производственных процессов биосинтеза; анализе готового продукта и стандартизации музейных культур.

Относительное содержание живых микроорганизмов, %

Предлагаемый Известный Контроль способ способ в водную среду вводят дигидрофосфат калия до достижения рН 4,0 — 4,7 и выдерживают в течение 2 — 10 мин, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР 1{ 473744, кл. С 23 Q 11//0066, 1973.

2. Лебедев В. С. Исследование структурных переходов в оболочке бактерий Е. Coll хемилюминесцентным методом. Канд. дисс. М., 1977.

973610

1,5

0,5

f составитель В. Голимбет

Техред Е,Харитончик Корректор У. Пономаренко

Редактор И. Митровка

Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул; Проектная, 4

Заказ 8617/29 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5