Способ определения витаминов группы е

 

(72) Авторы изобретения

П. ф. Сурай н M. С. Жедек

Украинский научно-исследовательский институт птицеводс тва (7I ). Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ

ГРУППЫ Е

Изобретение относится к химическим

Методам определения витаминов группы Е (токоферолов) с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТХС) и может быть использовано при определении содержания токоферолов в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканях живот ных (например, для контроля их Е-витаминного кормления) в медипинских, вете ринарных и других биологических исследованиях, а также для контроля производства витамина Е.

Известен способ определения витаминов группы Е в биологическом материале . включающий экстракшпо общих липидов нз ткани органическими растворителями, выделение и очистку токоферола методом тонкослойной хроматографии, окисление его дотокоферилхинона и спектрофотометри- - 0 ческое определение послепнего (1).

Недостатком способа является его относительно невысокая чувствительность.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому ре зультату является способ определения витамина Е в биологическом объекте, заклю чающийся в том, что навеску материала омьпппот спиртовым раствором щелочи, экстрагируют иеомыляемые липкцы L эфиром и отмывают дистиллированной водой донейтральной реакции, высушивают эфирный экстракт сульфатом натрия, упаривают его, растворяют в малом объеме растворителя и наносит на специально приготовленные хроматографические пластинки с незакрепленным слоем, обнаруживают токоферолы при ультрафиолетовом облучении по свидетелю, снимают с пластинки слой адсорбента и ыпоируют витамин Е растворите-, лем, упаривают раствор витамина, раство ряют остаток в спирте, производят цветную реакцию и фотометрируют полученный раствор. Концентрацию витамина Е определяют по предварительно построенной колибровочной кривой f 2) .

3 9742

Недостатками известного способа являются длительность анализа, низкая точность н чувствительность.

Пель изобретения — сокращение длительности анализа, а также повышение точности и чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения витаминов группы Е путем омыления анализируе-мой пробы в присутствии "пирогаллола в l0 атмосфере азота при 90-95оС, экстракцни эфиром неомыляемой части пробы, высушивания эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хлороформе, с последующим тонкослой- IS ным хроматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографическую пластинку, после чего пластинку с хлороформным раствором обрабатывают цветореагентом - смесью р0

g- / -дипиридила и хлорного железа с последующим элюированием окрашенного адсорбированного слоя смесью содержащей этанол, соляную кислоту, фосфорную, кислоту и бидистиллированную воду, при ZS следующем соотношении компонентов, об.%:

Этанол 45 - 55

Соляная KHGJIoTG 20 — 30

Фосфорная кислота 6-10

Бидис тилированная 30 вода 5 - 29 и фотометрированием элюента.

Предлагаемый. способ позволяет селективно определять изомеры витаминов группы Е (токоферолов), причем локали; 35 зацию токоферолов a(,-изомера определяют по свидетелю, а p + ®Q нэомеров - по величине Ку

Пример. Определение витамина Е в печени индюков.

Наьеску гомогената печени (3-5г) переносят в колбочку для омыления, добавляют 50 мл этанола, 100 мг ггарагаппола, 5 мл 60%-ного раствора гидроксида калия, присоединяют обратный холодильник, продувают азот 6 7 мин и омыляют на глицериновой бане 20 мин при 90

95 Ñ. Затем охлаждают и трижды экстрагируют неомыляемую фракцию эфиром пор днями по 40 мл. Затем эфирный экстракт отмывают до нейтральной реакции дйстиллированной водой по бромтимоловому синему, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают в токе азота на роторном . испарителе. Далее сухой остаток растворяют в 0,1 - 0,2 мл хлороформа и микро»

Я шприцем (наыосят О,OS 0,1 мл раствора на стартовую линию хроматографической пластинки в вире полосы длиною 20

62 ф

30 мм. Рядом наносят свидетель-пример.но 3-5 мкг оС =токоферола.

Хрома тографическое разделение токоферолов на подготовленных пластинках осуществляют в камере, насыщенной . парами хлороформа, через которую в течение 15 мин продувают азот. Когда фронт растворителя приближается к верхнему краю пластинки, необходимо извлечь ее из камеры и высушить в токе азота при

35- 40 С. Затем обильно опрыскивают пластинку свежеприготовленным проявляющим раствором, состоящим из равных объемов 0,5%-ного раствора <, о -дипиридила и 0,2%-ного раствора хлорного железа и этаноле.

Обработанную пластинку выдерживают в горизонтальном положении 5 — 7 мин, чтобы проявляющий раствор впитался адсорбентом и количественно прореагировал с витамином Е с образованием роэовокрасного пятна. Затем подсушивают пласо тинку в инертной атмосфере при 20-25 С определяют локализацию о -токоферола по свидетелю и количественно переносит окрашенный участок адсорбента в пробирку с притертой пробкой.

Затем в пробирку приливают 3 мл

; элюирующей смеси, состоящей иэ этанола, соляной и фосфорной кислот и бидистиллата в объемных соотношениях 6: 3: 1: 2, энергично встряхивают 15 - 20 с и филь| ° руют через обеззоленный фильтр (красная лента). Сполоснув пробирку 1 мл этой же смеси, переносят ее на тот же фильтр.

Полученный розовый фильтрат фотометридчот при - 530 нм, по сравнению с элюирующей смесью. Содержание витамина Е вычисляют по формуле

Ч 9 ч„ где Е - содержание сС.-токоферола в ткани, мкг/г; - объем хлороформа, в котором растворена проба, мл;

V - объем хлороформенного раствора, 1 нанесенного на пластинку, мл; у навеска субстрата> г

g - количество g -токоферола по калибровочному графаку.

Пример 2. Определение иэомеров токоферола в травяной муке. .Навеску травяной муки (1-2 г) переносят в копбочку с притертой пробкой, заливают 100 мл эфира и,ac.òðàõèâàþò иа шюттель-аппарате 20 мий. Затем филь руют и упаривают эфир в атмосфере азота иа роторном исцарителе. Сухой остаток

Предлагаемый 30,94+0, 158 6

56,7 2-60

Извес т ный

24,6+0,82 6

82, 9 159 14-40

Таблица 2

Содержание компонентов в смеси, об.%

Компонент

40 42 45 50 55 58

Э танол

25 25 25 25

8 8. 8 8

27 22 22 17

25 25

8 8

12 9

Соляная кислота

Фосфорная кислота

Бидис тиллат

Определение,С -токоферола, % 88,4 94,8 98, 9 100 98, 7 93,6 90, 1

50 SO 50 50 50 50 SO

1S 17 20 25 30 33 35

Этанол

Соляная кислота

Фосфорная кислота .8 8 8 8 8 8 8

Бидис тиллат 27 25 22 17 12 9 7

Определение о . -токорола, %

90,1 : 93,2 97,9 100 98,2 94,6 90,0

50 50 50

2S 25 25

2. 4 6

23 21 19

Этанол

Соляная кислота

50 50 50 50

25 25 25 25

8 .10 15 20

17 1S 5

Фосфорная кислота

Бидистиллат

79,6 90, 1 99,4 100 99,6, 92,6 90, 1

Определение -токоферола, %

5 97426

pBcTBopfiloT в 0,05 -0,1 мл хлороформа и . микрошприцом наносят 0,025 - 0,05 мл этого раствора на стартовую линию хроматографической пластинки (пластинку не нагревать!) в виде полосы, длиною 4080 мм. Рядом наносят свидетель, содержаший примерно 3- 5 мкг ос. -токоферола.

Процедуры хроматографирования, опрыскивания и подсушивания пластинки такие же, как и при определении витамина Е в пе- >4 чени, определяют локализацию токоферолов сС-изомерК по свидетелю. а P + -по величине Ку .. Все дальнейшие процедуры такие же, как и определение витаминав примере 1. При отсутствии специальных 1% свидетелей допустимо определение концентрации изомеров по калибровочному графи ку построенному по о -токоферолу.

На пластинках "Силуфол" разделяется

3-40 мкг витамина Е. Если интенсивность окраски пятна мала, цветной комп- лекс элюируют из нескольких пластинок.

При элюировании пятен спирто-водным раствором кислот расхождения между параллелями не превышают 1% и окраска элюита устойчива 15-20 мин.

Сравнительные данные определения о(.-токоферола в желтке индюшиных яиц приведены в табл. 1.

В табл. 2 приведено определение допустимых пределов состава вешества.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа. Вследствие его большей точности, чувствителт ности и селективности по сравнению с

%, известным способом удобно его исполь- . зование для определения изомеров токо феролов в травиной муке, витаминная ценность которой определяется не суммой изомеров, а содержанием только (.-токоферола, что позволяет более рационально использовать Е-витаминные корма. Табли ца 1

7 974

Ф орм ула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кейфах Е. А., Буробина С. А.

Is Количественный метод определения токоферола и его производных в тканях животных. - "Вопросы медицинской химии".

1967, т.XtN., М 1, с. 94 - 97.

2. Крюков.В. С., Дмитровский А. А. е и др. Определение витаминов А. Е и каротиноидов в кормах,, препаратах и биологических объектах. Методические рекомендации ВНИТПП, Загорск,1978, с. 3-.

23.

Составитель

: Редактор Н. Киштулинец Техред М.Тенер

Корректор И. Ватрушкииа

Зз 8686/61 Тираж 887 - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ определения витаминов группы Е путем омыления анализируемой пробы, экстракции эфиром неомыляемой час ти пробы, высушиваиия эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хлороформе с последующим тонкослойным хроматографическим разделением полученного раствора путем нане сенин его на хроматографическую пластинку с использованием элюирования ад,. сорбированного слоя, обработки цветореагентом и фотометрирования элюента, ! о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью сокращения длительности анализа,, 1 повышения точности и чувствительности способа, омыление ведут в присутствии пирогаллола в атмосфере азота при 90

95 С и пластинку с хлороформным раствором обрабатывают цветореагентом,смесью aL,- с -дипиридила и хлорного

S железа с последующим элюированием окрашенного адсорбированного uioa сме

262 8 сью содержащей этанол соляную кисло.ту фосфорную кислоту и бидистиллирован-" ную воду, при следующем соотношении компонентов, об. %:

Этанол 45 - 55

Соляная кислота 20- 30

Фосфорная кислота 6 - 10

Бидистиллированная вода

5-29

10 и фотометрированием элюента.