Способ выделения @ -зависимой супероксиддисмутазы из печени крысы
ОПИСАНЦЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Сеюз Советских
Соцналмстнческмх
Республик
< 19?9506
{61) Дополнительное к ввт. свид-ву(22) Заявлено 280481 {21) 3301597/28-13
РЦМ.КП.
С 12 и 9/02 с присоединением заявки Ж, (23) Приоритет
Государственный комитет
СССР яо делом изобретений и открытий
Опубликовано 0712р2 бюллетень Мо45 (53) УДН 577. 15..07(088.8) Дата опубликованир описания 071232 (72) Авторы изобретення
I I
Ленинградский химико-фармацевтический институт
М„„Ф (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЦДЕЛЕНПЯ Zn, Cu-ЗАВИСИМОЙ
СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ
КРИС Ь1
ИзобретениЕ относится к химической энэимологии и может быть использовано в медицинской промышленности и в лабораторной практике для получения фермента Zn, Cu-зависимой суперокаиццисмутаэы (1.15.1.1) иэ печени крысы, которая может найти прн" менение в различных отраслях народного хозяйства.
Супероксиддисмутаза может найти применение для защиты.от проникающей радиации, от токсичности высокого уровня кислорода в газовой смеси для дыхания, в качестве антимутагенного фактора, в онкологии, геронтологии, пищевой промышленности.
Фермент специфичен к субстрату
О и катализирует следующую реакцию:
02 + 02 + 2Н Ha02 + 02, реакцию спонтанной дисмутации супероксида.
Известно, что в активный центр
„ супероксидцисмутаз входят многие металлы. Так, в клетках печени крысы найдено два типа супероксиддисмутаз: Zn, Cu-зависимая (в цитозольной фракции) и Мп-зависимая (в митохондриях).
Известен способ выделения Zn, Сизависимой супероксиддисмутазы из печени.крлсы, включающий гомогениэирование сырья в экстрагирующем растворе, центрифугированием при
13000 о для отделения супернатпнта, обработку сунернатаита, содержащего
Ип-зависимую и Zn, Cu- зависимую супероксиддисмутазы, смесью этанолхлороформ (0,25V:0,15V) для уничтожения Мп-зависймой локализующейся в митохондриях супероксиддисмутазы с последующим центрифугированием смеси при 13000 gpss).
В полученный раствор добавляют
К2НРО4. для высаливания примесей, осадок отделяют и осаждают иэ надосадочной жидкости белки ацетоном (2Н), Ацетоновый осадок растворяют в К-фос. фатном буфере (рН 7,8) и диализуют в течение 15 ч. Затем проводят хроматографию при рН 7,8 на колонке, заполненной сефадексом С-75. Фракции,.содержащие супероксиддисмутазу, диализуют и разделяют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе с элюцией линейным градиентом МаС1 от 0-0,2 М. Активные фракции концентрируют на мембране
Amicon UM-10 до содержания 3-5 мг
Наименование используемых реактивов
Степень чистоты
Длительность фракционирования, r
Способ выделения и очистки
Количество стадий
Известный а) этанол б) хлороформ в) ацетон
Около
80 ч
3 97950 белка/мл. При использовании этого метода степень частоты равна 118, а длительность фракционирования составляет примерно 80 ч (;1).
Такая многоступенчатая очистка приводит к частичной денатурации фермента, во-первых, за счет применения органических растворителей и, во-вторых, из-за длительности процедуры Фракционирования.
Однако данный способ характери- 10 зуется недостаточно высокой степенью чистоты целевого продукта и сложностью процесса выделения. . Цель изобретения — повышение степени чистоты фермента СОД и упроще- 15 ние способа его выделения.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения
Zn, Cu-зависимой супероксиддисмута-, зы из печени крысы, заключающимися в гомогенизировании сырья и экстракции фермента, удалении Nn-зависимой супероксиддисмутазы и осаждении выделяемого фермента ацетоном с последующей хроматографией на полисахаридном сорбенте при рН 7,8 с элюцией буфером, содержащим NaCl, удаление Мпзависимой супероксиддисмутазы осуществляют. центрифугированием гомогената при 105-110000 g, ацетон для осаждения Zn, Си-зависимой супероксиддисмутазы из полученной после высокоскоростного центрифугирования цитозольной фракции используют в объемном соотношении 1:(1,5-1,7), а хроматографию проводят на диэтиламиноэтил-сефадексе. с элюцией ступенчатым градиентом NaC1 0,05-0,1 М, причем стадию хроматографии проводят дважды.
Предлагаемый способ позволяет 40 повысить степень очистки до 250 раз, сократить длительность процесса выделения на 20 ч и значительно упростить сам процесс.
Пример. Охлажденную печень 45 крыс гомогенизируют при О С в растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 1 мм ЭДТй, рН 7,4, из расчета нб 1 r ткани 10 мл раствора. Гомогенат центрифугируют при 105000 g в течение 60 мин. К надосадочной жидкости (цитозольной фракции) добавляют при перемешивании 1,5 объема охлажденного ацетона и полученный осадок отделяют центрифугироваиием в течение 20 мин при 1000 g. Затем осажденную ацетоном фракцию суспендируют в минимальном объеме 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,8 и диализуют
5 ч против 100 объемов этого же буфера. Дальнейшую очистку проводят на колонке размером 400 25 мм, запол. ненной ДЭАЭ-сефадексом А-50 и уравновешенной 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,8.
Белки сорбируют при пропускании через колонку 5 мм фосфатного буфера, рН 7,8, а затем элюируют, используя ступенчатый градиент хлорида натрия: первоначально промывают колонку
5 мМ фосфатным буфером, рН 7,8, содержащим 0,05 М йа01, а затем этот буфер заменяют на 5 мМ фосфатный буфер, рН 7,8, содержащий 0,1 М КаС 1.
Фракции с максимальной активностью энзима собирают и диализуют против
5 MM фосфатного буфера, рН 7,8 в течение 3 ч. Затем рехроматографируют их на колонке размером 150>10 мм, заполненной ДЭЛЭ-сефадексом А-50.
Сорбцию и элюцию проводят при тех же условиях: энзиматически активные фракции "выходят" при вымывании белка 0,1 М НаС1.
При таком способе выделения степень чистоты фермента составляет
250, а продолжительность фракционирования около 60 ч.
Конечную чистоту препарата определяют методом электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле (электрофоретическое разделение проводят в трисглициновом буфере, рН 8,3, при силе тока 5 мА на один столбик геля, продолжительность процедуры 2,5 ч).
Для выявления зон, содержащих активность СОД, гели окрашивают специфическими для данного фермента реактивами. В результате всем полученным белковым зонам при окрашивании амидовым черным соответствуют зоны активности СОД.
Удельная активность гомогенного препарата (45й3) 000 ед/мг.
В таблице приводятся сравнительные данные известного и предлагаемого способов выделения и очистки фермента СОД из цитозола печени крыс.
979506,Продолжение таблицы
I Е г) сефадекс 75 д) ДЭАЭцеллюлоза
Предлагаемый а) ацетон
Около
60 ч б) ДЭАЭсефадекс
А-50
250
Формула изобретения
Составитель О. Скородумова
Редактор А. Гулько Техред-С.Мигунова Корректор М. Демчик, Заказ 9282/9 Тираж 505
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035,, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное
Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Проектная, 4
Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет сравнительно быстро. получать фермент
СОД с большей степенью чистоты в иативном состоянии беэ значительного ингибирования его активности. Способ может быть использован в промылленных целях для получения СОД.
Способ выделения Zn, Cu-зависимой супероксиддиамутазы из печени крысы, включающий гомогенизирование сырья и экстракцию фермента, удаление Мп-зависимой супероксиддисмутазы, осаждение выделяемого фермента ацетоном с последующей хроматографией. на полисахаридиом сорбенте при РЖ:..7+ с элюцией буфером, соJ держащая, naCi, о т л и ч а ю щ и и с я те1., что, с целью повышения степени чистоты пелевого продукта и упрощения процесca, q даление Nnзависимой суперсксивдисмутазы осуществляют центрифугированием гсмогената при 105-110000 g, ацетеи для осаждения Zn, Cu-зависимой супероксиддисмутазы из полученной цитозольной фракции используют в объемном соотношении 1:(1,5-1,7), хроматографию проводят на диэтиламиноэтилЗО сефадексе с элюцией ступенчатым градиентом NaCl от 0,05 до 0,1 М, причем хроматографию проводят дважды.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
35 1. Reiss U. Gershon D. "Rat 1)ver
supегоxide дТsmutase Purification
and age-related modificat)ons", Fur. J. Biochem, 1976, vol. 63, 617-623.
