Способ получения гибридов соматических клеток

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОВ СОМАТИЧЕСКИХ Ю1ЕТОК путем скрещивания родительских клеток, выращивания на питательной среде монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, рассев смешанных культур , удаления из культуральных флаконов родительских клеток и культивирования оставшихся гибридных клеток до образования колонии, отличающий .с я тем, что, с целью у лучшения воспроизводимости и снижения трудоемкости способа, рассев клеток производят при соотношении 1:3-1:5, удаление из культуральных флаконов родительских клеток осуществляют путем обработки смешанных культур раствором трипсина при 36-38с в течение 1-5 мин двух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещивания до полного удаления всех ро-дительских клеток. (Л с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) 01) 3(51) С 12 N 5 02

ollNcAHME изоьгятяни :,:

К ABT0PCH056V СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изоБРетений и ОтнРытий (21) 3281964/30-15 (22) 24 ° 04.81 (46) 30.09.83. Бюл. М 36 (72) A.Н. Мустафина и В.A. Лашкевич (71) Институт полиомиелита и вирусных экцефалитов (53) 575,12.591.044(088.8) (56) 1. Рингертц Н.И. и Сэвидж P.

Гибридные клетки. М., 1979, с.174-190. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОВ

СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК путем скрещивания родительских клеток, выращивания на питательной среде монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, рассев смешанных культур, удаления из культуральных флаконов родительских клеток и культивирования оставшихся гибридных клеток до образования колонии, о т л и ч а ю— щ и и .с я тем, что, с целью улучшения воспроизводимости и снижения трудоемкости способа, рассев клеток производят при соотношении- 1:3-1:5, удаление из культуральных флаконов родительских клеток осуществляют путем обработки смешанных культур раствором трипсинапри 36-38 С в течение 1-5 мин двух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещнвания до полного удаления всех ро.дительских клеток.

984215

Изобретение относится к области генетики соматических клеток, касается гибридизации соматических клеток, а именно выделения гибридов.

Выделение гибридов является одним из этапов способа гибридизации соматических клеток. Соматические гибриды широко используются в различных областях биологической науки, в частности в генетике, онкологии, вирусологии, биологии клетки, биологии развития. В последнее время сделаны первые попытки использовать гибриди» зацию соматических клеток для решения важных практических вопросов (лечение рака и инфекционных заболе- 15 ваний с помощью моноклональных антиI тел„синтезированных в гибридах клеток, получение интерферента и его очистка, выведение хозяйственно важных видов растительных гибридов). 2О

Гибриды соглатических клеток получают слиянием двух или несколько клеток с образованием гибридной клетки.

Для этого смесь родительских клеток подвергают определенной обработке, при которой часть клеток сливается и образуются гибриды, состоящие из

2-3 родительских клеток. Следующий этап работы заключается в выделении чистой, желательно клональной, кульl туры гибридных клеток из смешанной популяции. Как правило, гибридные клетки растут медленнее родительски:< и < .ocTcti3!IHIQT небольшую -1асть популяции, поэтому их выделение . 35 представляет значительные трудности. B настоящее время для этой цели используются два способа (1!., неселективный и селе|<тивный. Неселек тивный способ заключается в том,что . 4О единичные гибридные клетки механи чески выделяют из смеси с родительс кими и получают из них клональные культуры. Способ отличается черезвы-; чайной трудоемкостью, так как для того чтобы получить несколько гибридных клонов приходится выделять огромное количество клеток. Кроме того, получение клонов из одной клетки возможно только при использовании посуды и питательных сред высшего качества. Более широко используется селективный способ выделения гибрид; ных клеток, который заключается в том, что скрещивают мутантные клетки (например, дефектные по определен-зз ным ферментам, ауксотрофные или температурочувствительные мутанты), смесь родительских и гибридных клеток культивируют в условиях, способствующих размножению только гибридныхбо клеток (селективные среды, непермиссивная температура). Недостатком способа является то, что он позволяет скрещивать только мутантные.клетки. Способ довольно сложен, так как 65 требует создания селективных условий (питательные среды, темлература). Кроме того, на определенном этапе при использовании этого способа везникает необходимость в очень редком рассеве культур (1:20), во-первых, для того, чтобы избежать метаболической кооперации между гибридными и родительскими клетками, и, во-вторых, для получения клональных линий гибридных клеток, что в свою очередь требует питательных сред и посуды высшего качества.

Целью изобретения явЛяется улучшение воспроизводимости и снижение трудоемкости способа..

Для достижения цели в. способе получения гибридов соматических клеток путем скрещивания родительских клеток, выращивания на питательной среде монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, рассева смешанных культур, удаления из культуральных флаконов родительских клеток и.культивирования оставшихся гибридных клеток до образования колоний,рассев клеток производят при соотношении 1:3-1:5 удаление из культуральных флаконов родительских клеток осуществляют путем обработки сглешанных культур раствором трипсина при 36-38аС в течение 1-5 мин с двух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещивания до полного удаления всех родительских клеток.

Пример- 1. Выделение соматических гибридов при скрещивании в мо нослое перевиваемых клеток мыши Bag и диплоидных;@ибробластов человека.

В качестве родительских клеток берут перевиваемые клетки опухоли гыши и диплоидные эмбриональные фибробласты человека. Обе культуры снимают са стекла при пассаже с помощью

О,?5Ъ-ного раствора трипсина при

37еС в течение 1-2 мин. После слияния родительских клеток в монослое путем обработки их раствором поли1этиленгликоля, смешанные культуры . в течение 24 ч культивируют в среде

Игла с 10% бычьей сыворотки. Затем монослой рассаживают из расчета 1:3 или 1:5. Через 2-3 дня в культурах образуется монослой, соСтоящий из родительских мышиных, родительских человеческих клеток и гибридов, полу. ченных от их скрещивания. Для удаления родительских клеток из смешенных культур их обрабатывают

0,25%-ным раствором трипсина при Зб38 С в течение 1-2 мин, Отщепившиеся при обработке трипсином родителькие клетки и те гидриды, степень адгезивности которых близка к родительской, смывают со стекла средой и удаляют из культуральных флаконов.

Гидриды с большей чем у родительс984215

Составитель A. Макаров

РедаКтор О. l0pKQBa ТехредМ,Костик Корректор A. Ильин

Заказ 8252/7 Тираж 523 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская. наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r..Óæãîðoä, ул. Проектная, 4 ких клеток, адгезивностью, при этом остаются на стекле. Их заливают средой Игла с 10% бычьей сыворотки и культивируют до образования монослоя, после чего обрабатывают трипсином, как описано выше. Для полного удаления родительских клеток из популяции достаточно обработать трипсином смешанные культуры после слияния 2-3 раза. B результате на стекле культурального флакона оста- 10 ются отдельные колонии гидридных клеток. Каждая колония представляет собой потомство одной гидридной клетки. Цля получения клональных линий каждую колонию отдельно снимают со $5 стекла путем обработки смесью равных количество 0,5%-ного раствора трипсина и 0,04%-ного раствора версена при 37ОС в течение 3-4 мин и культи; вируют в среде Игла с 10% бычьей сыворотки.

Способ основан на том, что часть образовавшихся при скрещивании в монослое гибридных клеток обладает большей адгезивностью, чем обе родительские культуры. Влагодаря этому родительские клетки могут быть удалены иэ культуральных флаконов посредством мягкой обработки трипсином, а гибриды с большей адгезивностью остаются на стекле и используютсн для получения чистых культур.

Кроме того, присутствие в культурах небольшого постепенно уменьшающегося количества родительских клеток в те)t чение 2-3 недель после слияния кондиционирует питательную среду, что способствует лучшему выживанию и размножению отдельных гибридных клеток, которые образуют на стекле флакона колонии, представляющие собой потомство одной клетки. К времени полного удаления родительских клеток из культур гибридные колонии достигают достаточно большого размера и могут ,быть использованы для получения кло нальных линий гибридных клеток.