Способ получения бактериальных амилаз

 

Сеюз Соаетскнх

Сецнапнстнческнх

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (tu990812 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 09.07 81 (21) 3316721/28-13 с присоединением заявки М— (Sl)N Кл.

С 12 N 9/32

С 12 N 1/20

Гасудаустаеиай кааитет

СССР ее гаваи. иаи4Ретеиий и еткуытмй (23) Приоритет (53) УДК 663.15 (088.8) Опубликовано 23.01.83. Бюллетень вй 3

Дата ояублмкованмя описания 23.01 83

В. И. Сухаревич, Н. М. Павловец, В. И. Яковлев, Э. С. Ста

i и И..И. Кюдулас

У

Ленинградский ордена Октябрьской Революции и орфе1тя

Трудового Красного Знамени технологический инст т

- им. Ленсовета (72) Авторы изобретения

= .л. : т ), я 3 я

- 4 ТОФИГ ъ . г:Х!Я фт -1р ч И (71) Заявитель

8КЯцФ . тт;„;, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АМИЛАЗ

Изобретение относится к области промыш1 . ленной микробиологии, а именно к техноло-! гии получения бактериального ферментного препарата амилосубтилина, который широко применяется в животноводстве, пищевой и

5 легкой промышленности.

Известны способы получения бактериальиых амилаз путем культивирования проду центов на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, фосфора, магния, калия, натрия, кальция, микроэлементы и необходимые факторы роста (кукурузный экстракт, гидролизаты дрожжей) (1).

Известен также способ получения бактериальных амилаз путем глубинного культиви-, 15 рования бактерий в жидкой аэрируемой среде следующего состава, вес.7o. .крахмал 24,0; кукурузный экстракт. (50% с.в.) — 1,20; сухие пивные дрожжи 0,24; лактоза 0,30; магний сернокислый 0,015; калий сернокиатый

" 20

0,30; аммоний фосфорнокислый 2-х замещенный 0,84; натрий хлористый 0,03; медь сернокислая 0,00039; окись кальция 0,012; кальций углекислый 0,03; амилосубтилин

ГЭХ 0,165; вода до 100 мл, рН 6,2 — 6,4 (2).

Недостатками известного способа является длительность процесса (56 — 70 ч) и недостаточно полное использование источника углерода.

Известно, что с увеличением концентрации питательных веществ абсолютный выход продукта увеличивается, но степень потребления, например, углеродсодержащих веществ снижается. Увеличить выход продукта от внесенных питательных веществ возможно за счет оптимизации условий культивирования.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта, йовышение эффективности использования утлеродсодержащего субстрата и сокращение времени ферментацни.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения бактериальных амилаз путем глубинного: культивирования бактерий рода Bacillus в жидкой питательной аэрируемой среде, содержащей источник углерода, азота, необходимые факторы роста, 25

Одновременно с посевом вносят и

0,001% феррицианид калия в виде стериль- 5о ного водяного раствора. При добавлении восстановителя ОВН среды снижается на 40 мВ по сравнению с его уровнем в контроле— в среде без восстановителя.

Выращивание продуцента проводят в колбах с 50 мл среды на качалке при

37 С. Через 48:ч культивирования определяют выход фермента.

Э 9908 а также минеральные соли и воду, в питательную среду перед культивированием одновременно с посевным материалом дополнительно вводят неорганический восстановитель снижающий Е h среды, в количестве 0,001—

005 вес.%, а также тем, что в качестве неорганического восстановителя используют феррицианид калил или гипосульфит натрия, или тиогликолит натрия. Добавление восстановителей в среду снижает окислительно1О восстановительный потенциал на 60 — 40 мВ, Положительный эффект наблюдается только в том случае, когда восстановитель добавляют в начале кулыивирования и не отмечается при добавлении его в последующие фазы роста продуцента.

В качестве продуцента а-амилаз используют промышленный продуцент Bacillus

subtilis SK — 52. Кулыивирование продуцента проводят в условиях аэрации на про20 изводственной питательной среде следующего состава, %: крахмал 10 и 24; кукурузный экстракт (50% с.в.) 1,20, сухие пивные

„дрожжи 0,24; лактоза 0,30; магний сернокислый 0,015; калий сернокислый 0,30; аммоний фосфорнокислый 2- х замещенный

0,84; натрий хлористый 0,03; медь сернокислая 0,00039; окись кальция 0,012; кальций углекислый 0,03; амилсубтилин ГЗХ 0,165; рН 6,2 — 6,4, В питательную среду перед культивированием одновременно с посевным материалом вносяг восстановитель в количестве 0,001 — 0,05%. Выращивание проводят в колбах на качалке при t = 37 С в течение 48 ч на среде с 10% и 69 ч на среде, содержащей 24% крахмала.

Пример 1. ОдносУточную культуру

Bacillus subti !is SK — 52 выращенную на картофельных столбиках, пересевают в жидкую ферментационную среду, содержащую, вес.%: крахмал 10,0; кукурузный экстракт (50% с.в.) 4o

1,20; сухие пивные дрожжи 0,24; лактоза

0,30; магний сернокислый 0,015; калий сернокислый 0,30; аммоний фосфорнокислый

2-х замещенный 0,84; натрий хлористый

0,03; медь сернокислая 0,00039; окись каль- 45 ция 0,012; кальций углекислый 0,03, амилосубтилин ГЗХ вЂ” 165; вода до 100 мл.

12 4

В условиях сниженного ОВП выход амилаэ на 27,6% выше, чем в контроле.

Пример 2. При выращивании того же продуцента Bacillus subtil is SK — 52 в условиях примера 1, но отличающихся тем, что количество восстановителя в среде 0,01%, а ОВП среды — на 60 мВ ниже,чем в контроле.

Через 48 ч культивирования выход амилаз на 33,3% выше чем в контроле.

Пример 3. При выращивании бактерий Bacillus subtil is SK — 52 в условиях примера 1, но отличающихся тем, что крахмал вносится в среду в количестве 24%, а восстановител ь — 0,01%.

Через 48 ч ферментации выход амилаз на 27,8% превышает выход в контроле и достигает такого уровня, который наблюдается в контрольных условиях тольКо через

69 ч культивирования. Через 69 ч ферментации выход амилаз в условиях сниженного

ОВП среды превышает выход в контрольных условиях на 24,4%.

Пример 4. При культивировании бактериального продуцента амилаз Bacillus

subtilis SK — 52 в условиях примера 1 на среде с 10% крахмала, но отличающихся тем, что в среду в качестве восстановителя используют гипосульфит в количестве 0,05%.

Уровень ОВП ферментационной среды при этом снижается на 55 мВ. Через 48 ч ферментации выход амилаэа в опытных условиях на 28,4% выше, чем в контрольных (без восстановителя).

Пример 5, При культивировании

Bacillus subtilis SK — 52 в условиях примера

1, но отличающихся тем, что в среду вносят в качестве восстановителя тиогликолят натрия в количестве 0,001% через 48 ч ферментации выход в опытных условиях на 22,6% выше,чем в контрольных (беэ восстановителя).

Результаты суммированы в таблице.

Добавление восстановителя в количестве

0,05 — 0,001% на 60 — 40 мВ снижает ОВП среды и позволяет увеличить выход бактериальных амилаз на 28% через 48 ч культивирования, а через 69 ч — на 52,2%, т.е. в этих условиях происходит более эффективное использование источника углерода.

На средах с повышенным содержанием крахмала (24%} и с восстановителем, уже через 48 ч ферментации уровень амилазной активности культуральной жидкости такой, какой в контрольных условиях (без восстановителя) достигается только через 69 ч ферментации.

Таким образом, реализация изобретения позволяет увеличить выход готового продукта, повысить эффективность использования углеродсодержащего субстрата и сократить время ферментации, 990812

Условия ферментации

Выход фермента %

Среда с 10% крах мала, время ферментации; 48 ч

128,5

Контроль

Опыт 0,001 (K4Fe(CN)6 0,01

127,6

152,2

127 8

133,3

128,4

Опыт 0,05 (+гипосульфит) Опыт (+тиогликолят натрия) 0,001

122,6

Эффект (среднее значение) 52,2

27,8

28,0. Составитель Е. Воробьева

Техред Т.Маточка Корректор У. Пономаренко

Редактор Г. Волкова

Заказ 57/37

Тираж 521 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

1. Способ получения бактериальных амилаз путем глубинного культивирования бактерий рода Вас11!ав в жидкой питательной аэрируемой среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые факторы роста, а также минеральные соли и воду, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения выхода готового продукта, повышения эффективности использования. углеродсодержащего субстрата и сокращения времени ферментации, в питательную среду перед культивированием одновременно с посевным материалом дополнительно вводят неорганический восстановитель, снижающий Eh среды, в количестве 0,001 — 0,05 вес.%.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве неорганического восстановителя используют феррицианид калия нли глиносульфат натрия, или тиогликолят натрия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

I. Калунянц К. А. и Голгер Л. И.,Микробные ферментные препараты. "Пищевая, промышленность". 1979, с. 10 — 28.

2. Промышленный регламент по производству ферментного препарата амилсубтилина. Г10Х, ГЭХ, 25.09.79.