Способ определения глюкозы в растворах

Авторы патента:

ОСИН НИКОЛАЙ СЕРГЕЕВИЧ

ПЕТУХОВ ВАЛЕРИЙ ГЕОРГИЕВИЧ

C12Q1G01N33/14 -

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«ii992570 (6l ) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 02.02. 81 (21) 3266365/28-13 (51)М. Кл.

С 12 Q 1/00

//6 01 и 33/1тт с присоединением заявки рм (23) Приоритет

Гееудеретеелеые квинтет

СССР (53) УДК ÓÓ.083 (088.8) кв делам етееретелий н открытии

Опубликовано 30.01.83. Бюллетень М "

Дата опубликования описания 30 .01.83

3©с®р .;

Ич 7»)я "ъ у . т :

71 Х@1Щ; . 3 ; (72) Авторы изобретения

Н.С.Осин и В.Г.Петухов

«.4,„, o лЯ

ЫЯ„- =, Государственный научно-исследовательский ийвттек ц "" - -*". "

», стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А.Тарасевича (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ

В РАСТВОРАХ

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, в частности к способам определения глюкозы в ра» створах, биологических жидкостях и суспенэиях микроорганизмов.

Известен способ определения глюкозы в растворах, включающий использование глюкооксидазы. По концентра" ции кислорода косвенно судят а содержании глюкозы в исследуемой пробе, так как в ферментативном окисле" нии глюкозы с помощью глюкооксидазы участвует кислород 1 ), К недостаткам способа относится использование дорогостоящих ферментов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения глюкозы в растворах путем Вне». уо сения в раствор индикаторных микроорганизмов и регистрации изменения физических свойств среды с последующим расчетом, Согласно известному.2 способу клетки Pseudomonas f luoresсепз иммобилизуют на коллагеновой мембране, мембрану помещают íà платиновый электрод, а сам электрод вносят в исследуемый образец жидкости и по показанию тока в цепи попярографического датчика определяют уровень глюкозы в растворе С2 2.

Недостатком известного способа является его сложность. Так, в каждом случае перед анализом необходимо осуществлять аэрацию анализируемой пробы и поддерживать концентрацию растворенного в среде кислорода на постоянном уровне. Кроме того, длительна и. сложна процедура изготовления колпагеновой пленки с иммобилизованными микроорганизмами. . Цель изобретения - упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения глюкозы в растворах путем внесения в раствор индикаторных микроорганизмов

3 A/2)j и регистрации изменения физических свойств среды в качестве индикаторных микроорганизмов используют бактерии Escheriспiа со1i регистри< руют изменейие рН > а расчет ведут по формуле

Спро@„= рНпро ы > >i ñòñçíä . Сстамнд >

I где С -концентрация глюкозы в анапробы лизируемой пробе; . 1О дрН„ро гизменение рН от момента введения пробы до точки перегиба на прямой закисления среды;

С „„- концентрация глюкозы в стан- 1 дартной пробе; йрН - изменение рН на стандартстанд ную добавку глюкозы.

На фиг, 1 и 2 - изображены графики, поясняющие предлагаемый спосбб. !

Способ. осуществляют следующим образом.

Escherichia coll в анаэробных условиях расщепляет глюкозу по схеме глюкоза вЂ” ь2 лактат + 2 Н+, Глюкоза транспортируется в клетки микроорганизмов фосфоэнолтрансферазной системой, что исключает влияние на анализ других сахаров, кроме тех, что транспортируются той же системой, В ячейку с суспензией микроорганизмов Е. coll И-17 помещают электроды рН-метра и регистрируют исходный уровень рН среды ° Показания рНметра выведены на шкалу. самописца так, что 9,05 единицы рН соответствует полной шкале самописца. Добавляют стандартное (дозированное)количест40 во глюкозы в заданном объеме жидкости и регистрируют изменение рН среды, которое заканчивается после полного расщепления глюкозы микроорганизмами, Изменение потенциала на шкале самописца служит калибровкой для оценки количества глюкозы в анализируемой пробе с неизвестным его содержанием.

Затем добавляют анализируемую пробу жидкости и регистрируют изменение рН среды на добавку пробы с глюкозой. Определение количества глюкозы в анализируемой пробе проводят путем сравнения сигнала на шкале самописца от калиброванного ее количества и в анализируемой пробе. Чем больше глюкозы, тем больше вызвано ею изменение рН среды и соответственно изменение на шкале сомописца.

Добавка к суспензии микроорганизмов сложной среды, например, сахарозо-желатина с глюкозой, сопровождается закислением среды, причем это закисление резко снижается после потребления из среды глюкозы. На ленте самописца это регистрируется как достаточно быстрое линейное изменеwe потенциала первоначального уровня, а затем, после исчерпания глюкозы, изменение потенциала будет прои ходить с другой (меньшей) скоростью.

На ленте самописца это регистрируется как изменение угла наклона кривой закисления среды. Для определения глюкозы в этом случае необходимо учесть вклад s закисление среды количества неглюкозных компонентов, которое они успели произвести за вреMR расщепления глюкозы, На фиг. 1 представлены две кинетические записи изменения рН среды в суспензии микроорганизмов Е. co1i И-17 в процессе поглощения глюкозы, По оси ординат отложено закисление среды на добавку анализируемой пробы с глюкозой, 10 ЗИ глюкозы соответствуют калибровочному вектору дрН, отложенному по оси ординат. По оси абсцисс отложено время анализа в относительных единицах. Отрезок AB характеризует кинетику закисления среды в процессе поглощения глюкозы из анализируемой пробы, Т - время поглощения добавки глюкозы. I вЂ” кинетика изменения рН среды в суспензии микроорганизмов без других субстратов, которые могли бы быть утилизированы микроорганизмами. Il - кинетика закисления среды в суспензии микроорганизмов, содержащей утилизируемые,ими субстра ы. Количество кислоты, выделившееся на добавку глюкозы, обозначено рН, Пример 1, Испытуемые образцы, содержащие глюкозу в концентрации

10 И: дистиллированная вода, 0,8Я-ный раствор хлорида натрия, солевой раствор лактозы и арабинозы (1В лактозы и 14 арабинозы); раствор глицерина, сахарозы и желатина (1, 10 и li соответственно) .

В ячейку объемом 8 мл, термостатируемую при 20ОС, наливают 8 мл изотонического раствора хлорида натрия с 5 мИ фосфатного буфера и в эту среду вносят содержимое ампулы препарата

5 99257 колибактерин, который содержит около

30 млрд. кл, Е. со11 М-17.

После установления в суспензии анаэробных условий (приблизительно через 2-3 мин после растворения таблетки препарата) можно приступать к анализу глюкозы в пробах различных образцов. Для этого опускают электроды рН-метра в суспензию, измеряют уровень рН среды и автоматически so записывают сигнал рН среды на ленте самописца. Полная шкала самописца соответствует 0,1 единицы рН, Затем вносят с помощью микропипетки 0,1 мл водного раствора глюкозы с концентра- 1$ цией 10 3М и регистрируют изменение рН среды на эту добавку (фиг, 2).

На фиг, 2 представлены графические данные изменения рН при добавлении к бактериальной суспензии кле- рр ток Е. со}i М-17 различных по составу проб жидкости, содержащих стандартную концентрацию глюкозы 1(ГЗМ, Эти данные в дальнейшем используют для расчета количества глюкозы в ис- 2s следуемых образцах (стрелкой обозначено внесение 0,1 мл субстрата в бактериальную суспензию и начало резI

- J.. кого эакйсления среды ). Условия измерения: концентрация кле- за ток 30 млрд, кл,/мл; объем бактериальной суспензии 8 мл; состав среды

5 мМ раствор фосфатного буфера, температура 20 С ). В данном примере

0,1 мл раствора с 10 3М глюкозы вызывает изменение в 0,03 единицы рН

Количество глюкозы в пробе (определенное) по данному способу, м/л

Время анализа, мин.

Количество глюкозы в пробе (заданное), м/л

0,97-10 2

10-2

5,4-10 З

0,96 10 3

5-10 3

10-3

b,2

1,3

5,1- 10

5 -10-4

0,7

3,10-4

0,2 глюкозу как в водном растворе без других сахаров, так и в их присутствии.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным является более простым, он обладает выКак видно из таблицы, предлагаемый способ позволяет анализировать до 10 И глюкозы в объеме проб порядка 0,1 мл, при .этом обеспечивается точность около 103 до концентраций

5 .164М. Способ позволяет определять

О б не зависимо от субстрата. Затем вносят исследуемую пробу в объеме 0,1мл, Ответ на добавку составляет 0,06 единицы рН ° Следовательно, количество глюкозы в анализируемой пробе составит (О, 06: О, 03) ° 10 М=2 10 3М (в расчете на 0,1 мл пробы).

П р и M е р 2. В ту же ячейку вносят 0,1 мл разбавленного в 10 раз молока с растворенной глюкозой. В этом случае на ленте регистрируют сильное закисление среды, которое затем сменяется более слабым, В этом случае количество глюкозы в пробе рассчитывается из количества выделившейся кислоты в быстрой стадии закисления за вычетом количества кислоты, приходящимся на непрерывно идущую медленную стадию закисления. Так, в быструю стадию эакисления выделяется 0,095 рН, причем вклад медленной стадии составляет 0,015 рН. Следовательно, количество глюкозы в пробе составит (0,095-0,015)/0,03 ° 10 N=2,66-10%

Пример 3. В ту же ячейку вносят последовательно образцы проб объемом 0,1 мп, представляющие собой растворы глюкозы различной-концентрации. Каждая последующая проба вносится после окончания закисления на добавку предыдущей пробы.

Точность определения глюкозы в растворах предлагаемым способом приведена в таблице.

7 сокой избирательностью по отношению к глюкозе в присутствии других окисляемых субстратов в аппаратурном оформлении. Для реализации его необходимы обычный рН-метр и электрон. ный самопишущий потенциометр.

9925 формула изобретения

Способ определения глюкозы в раст11 ворах путем внесения в раствор индикаторных микроорганизмов и регистрации изменения физических свойств среды, отличающийся тем, что,с целью упрощения способа, в качестве индикаторных микроорганиз.мов используют бактерии ЕзсЬег!сЫа1 .coll, регистрируют изменение рН, а концентрацию глюкозы рассчитывают по Формуле проеы р проьы/ 1р ha стрэнд

8 где С 5,- концентрация глюкозы в анализируемой пробе;

AH Ьы- изменение рН от момента введения пробы до точки перегиба на прямой эакисления среды;

С - концентрация глюкозы в стандартной пробе

Ьр3 - изменение рН на стандартную добавку глюкозы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Brauner Н., Huller У. С,1исоэе

Best imungstand und Perspekt iven.

C>, 1980, 25, и 1-2, Ж "32.

2. Karube I Mitsuda S Suzukis.

Glicose sensor using immobilized

whole cells of Pseudomonas fluorescens..

61отесЬп,Э, 1979, 7, Н 4, р. 343-350 (прототип) .