Способ определения активности продуктов метаболизма микроорганизмов

 

И.А. Баснакьян, Т. А. Артемьева, А. Н. Лобанова А. Ц,,фласе и И. К). Ильницкая и"= «(И31ЦЯ

Б А» „-:Цяф.

7,, М осковский научно-исследовательский»йститут вакЩ@ » ...„, .... и сывороток нм. И.И.Мечникова (72) Авторы изобретения (7 I ) Зая вител ь (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ. ПРОДУКТОВ

М ЕТАБОЛИЗЯА МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к ветеринарной или медицинской микробиологии; в частно сти к способам определения токсичности .. экзотоксинов патогенных микроорганизмов в связи с получением анатоксинных препа+ ратов.

До настоящего времени при изучении токсичности культуральной жидкости И. регЕИп е»»ь и С.®рИФет4ае как в ус-. ловиях производства, так и в научных ио- о следовайиях определяютDP»nlмл в опытах на лабораторных животных.

Этот способ заключается в следукяпем.

Различные разведения дифтерийного токсина вводят внутрикожно (после выщи-, пывания шерсти на боках) морской свин= ке одновременно со стандартным токсином для реакции Шика. Определяют дозу испытуемого токсина, которая обусловливает ту же реакцию, что н.стандартный токсин.д»

Путем пересчета устанавливают величину

В Р»»»/мл.

Биологическую активность гангренозного, токсина определяют на белых мышах.

Каждое разведение токсина в физиолог»в ческом растворе в объеме 0.5 мл»вводят двум белым ыышам внутривенно (в хвост).

Отмечают наибольшее разведение токсина, которое вызывает гибель полпвины взятых

s опыт мышей в течение 2-х суток.-Ток. сичност»» выражают в Мп» /мл.

Однако лабораторные животные дорого стоят (1 белая мышь 40 коп., 1 морокая свинка - 7 руб. 96 коп); для содер» жания животных необходимо специальное помещение - виварий; способ сложен в технике выполнения (внутривенное введе ние белым мышам — в хвост, внутрикожное введение морским свинкрм).

Наиболее близким к изобретению является метод серийных или последователь-ных разведений, сущность которого заключается в том что из испытуемого вещества делается серия последовательных разведений. так, чтобы каждое последующее разведение было в 2 или 3 раза боль. ше предыду»пего (1 j. Для этого разливают питательную среду в пробирки в равных

3 объемах вносят в первую пробирку равный объем испытуемой жидкости и тщательно перемешивают. Переливаюи из первой про бирки во вторую половину содерапмого, перемешивают, из второй - в третью и т.д. Засевают пробирки одинаковой дозойтест-микроба. Через 18-20 ч, роста в термостате отмечают при каком максимальном разведении отсутствует рост тесчмикроба. Это разведение принимают 3й за титр или активность испытуемой жидкости, Однако известный .способ не позволяет определить слабо выраженную токсичность т.е. обладает невысокой чувствительностью. нестандартность питательных сред оказывает значительное влияние на рост микроба и, следовательно, искажает результаты определения биологической активности на основе роста микроорганизмов. Способ не .позволяет получить воопроизводимне результаты. Кроме того, на его осуществление затрачивается много времени. Поэтому известный метод нельзя использовать для определения токсичности культуральной жидкости на начальных этапах выращивания микроорганизмов, а также при изучении сда-

1бых токсинов.

Пель изобретения - определение ак- Е тнвностн экзотоксинов микроорганизмов рода клострндиум и рода коринебактериум.

Для достижения цели s способе определения активности продуктов метаболизма микроорганизмов,.включающем посев тест-микроба в определенных дозах в

33 серию пробирок с различными соотноше ниями смеси продуктов метаболизма и бульона, экспозицию с последующей оцен кой нх активности продукты метаболизмаэкзотоксины смешивают с бульоном в со. отношениях: 4,5 - 0,5: 0,5 - 4,5, в качестве тесчмикроба используют штамм

f,.оо61 К - 12; 200 PS., экспозицию проводят в течение 6 8 ч, а активность оценивают в относительных единицах ннгнбировання роста тест микроба.

П р н м е р. В ряд пробирок разлива ют питательную среду (бульон) в возрастающих объемах. В каждую пробирку вносят культуральную жидкость (экзоток- син) в убывающих объемах. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают. Получают следующие соотношения экзотоксина н бульона: в пробирке N.1 «5 0 мл экзотоксина, >>

% 2 - 4,5 мл экзотоксина и 0,5 мл бульона, %3 4,0 мл токсина и 1,0 мл бульона, %4 - 3,5 мл токсина н 1,5 мл бульона и т.д. до одиннадцатой пробирки, в которой 5 0 мл бульона.

Все пробирки засевают одинаковой дозой тес микроба и помешают в термостат цри 37 С. Через 6 В ч роста определают визуально с помп щью стандарта мутности нли фотоэлектроколорнметромнефэлометром. оитическую пиотность суспейзии в каждой пробирке. Строят график зависимости оптической плотности суспензии (ось ординат) от концентрации экзотоксийа (ось абсцисс), определяемой по соотношению: экэотоксин - бульон s

% экэотоксина. На оси ординат отмечают точку, соответствующую 50% от максимального значении оптической плотности.

Через найденную точку проводят прямую, параллельную оси абсцисс до пересечения с кривой.

Через точку пересечении с кривой опускают перпендикуляр на ocr абсцисс.

Точка пересечения с осью абсцисс дает процентное содержание экзотоксина в булы оне, соответствующее 50%-ному ингибнрованию роста.

Делят 100% (цельная культуральная жидкость - экзотоксин) на полученное процентное содержание соответствующее

50% ингибированию, н получают з.начение токсичности, выраженное количеством единиц ингибнрования. За единицу ингибированиа >U принимают активность такого токсина, который в неразведенном состоании подавляет на 50% рост 7-мн часовой культуры EайчЧс йа СОИ К 12

200 PS .

Теоретической основой предлагаемого способа является использование принципа ингибировання (подавления) роста культуры гетерологич ного микроорганизма для введения новых единиц измерения биологической активности токсинов - едннициигибирова ниц.

Способ апробирован в лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов и в цехе вакцин и анатоксинов предприятия по производству бактерийных препаратов М:НИИВС им.

И. И.Мечникова. С этой целью использованы различные экзотоксины„

Тесь-штамм ЕэсЪеИсФйе Co0i К-12;

200 PS сохраняют в высушенном состоя нии в ампуле нлн в полужидком агаре в пробирке. С полужидкого агара делают пересев петлей в пробирку с бульоном .

Хоттингера на 18 ч. После этого делают еще один пересев в бульон на 3 ч. Эту культуру рассевают петлей в цробиркн с различнымн разведениями испытуемой

5 993947 6 культуральной жидкости (токсина) в пи- основанный на измерении стандарта, мут» тательной среде (бульоне). При атом пер- ности, не уступает методу определения. с вая пробирка содержит 5,0 мл токсина, помощью прибора. вторая - 4,5 мл токсина и 0,5 мл буль- В примерах на фиг. 2,3,4,5 получены она, третья - 4,0 мл токсина и 1,0 мл > следующие величины: на фиг. 2 - 37%, бульона и т.д. до одиннадцатой пробирки, 100 2 70gg 50 л

Э содержащей 5,0 мл бульона.

Культуры в пробирках выращивают в на фиг. 3 - 79%, -э у- ** 1,2630 50/мщ термостате при 3 ? С в течение 6 8 ч ф 4 73% 00 1 373050/

Затем определяют мутность выросших Io - -3 культур визуально с помощью стандарта

100 мутности или оптическую плотность с по на фиг.5-11%, * 9,093050/мл.

11 мощью ФЗК-Н.

Эти значения xopoma коррелируют с

Строят график зависимости мутности . иЭР /мл, определенными в тех или оптической плотности культуры (ocs ординат) от концентрации екзотоксина в бульоне (ось абсцисс) (ф"г. 1,2,3,4,5). ° и 1,373U 50/мл; 1000ОЬ/мл соотНа фйг. 1 дано +Be зависимости, одна и: у 2 70Я/ 50/ 100000 иэ ко орых п строена на основе дан х / л с ответствует 9,09 9У 50/мл. стандарта мутности другая - по показаны- и мл соответствует

1 26 табл. 1 илсрирует разницу )3 чув ям ФЗК-Н. ствительности известного и предлагае»

На оси ординат отмечают точку, сооъмого способов на прймере токсина CP.. тву"щу середине Р"сстоя " меду " И б 1 рег r ngens типа Д. з та л. видно, началом координат и максимальным значто, ориентируясь только на известный чением оптической плотности или мутнос - 2S метод, можно было бы заключить, что ти. Через найденную точку проводят пряиспытуемое вещество не обладает токсичмую, параллельную оси абсцисс до пересьностью, т.е. токсичность его равна нулю, чения с кривой. Из точки пересенения поскольк во всех пробирках обнаруживалопускают перпендикуляр на ось абсцисс. ся ост тест-мик оба, обозначаемый знаПолучают точку, соответствующую пр „ся рост тест-микроба, об центному содержанию акзотоксина в буль ком + . Однако в опытах на оне при ингибировании роста на 50% - шах установлено что данный екзотоксин

Делят 100% на полученную величину и обладает токсичностью, измеряемой определяют количество единиц ингибирова80ОРЬп/мл. П длагаемый способ позвония. лил определить, что испытуемое вещество токсично, поскольку в пробирках, содержа»

В примере на фиг. 1 в случае исполь щих от 100 до 70% испытуемого вещестзования оптической плотности, определен- ва, роста тест микроба не было, что обоной по ФЭК-Н, количество единиц инги- . значается знаком "- . В пробирках с от бирования равно 2,33, а при использова ношением экзотоксина к бульону, равным нии стандарта мутности оно составляет 3/2, т.е. 60%, был слабый рост ф,, что

2,17. Оба метода дают близкие значения соответствует 100/70 = 1,4 единицам единиц ингибирования. Визуальный метод, ингибирования.

МЙ947 (О о

О

Я + о

lQ

Ф

lQ

О Ф о

lQ

Щ

lQ

Я (О с4

lQ 1 1

lQ

Я

lQ о О Ф

8 о о о

° 1

Ot

М

М

Э

Р (6

W е о

LO

О

П

Ц, k

О И

3 р5 сч Р со ,щ Ф

Ю

Ф (® ч ® + о

О 44

6l е).. Ф щ R а

3 с .в

I +I и II

l i)j l

I I

Ж

)ф °

g ЬОЫ47 10

Таким образом, даже если использо- . ронання принимают модель 60% ингибиро вать визуальный учет результатов, что .. ванин роста микроба:в данщис условийх. было сделано для достоверности сопос" . Эту модель получи от путем делении..иа тавлан я способов, предлагаемый способ 2 эначенни,опщчаской ипотиосФи-.-аусат» позволяет определить биологическую ак S эии,. шяросшей в щ обирхе с буюн.оном тивность токсинов, неопределиемую нз - .- se содержащей екзотоксииа. .вестюм способом, за счет расширения . днвпаэони исш)льэуемых конпВнтралий зк . Экономический фасче% » приведенный зотоксина. в табл. 2 и таба.. 3, свидетельствует о

Пре емый:xeiiog ис«лвчает невес- ? высокой e«osoatmsoeta агдемогЬ. пропзводнмость результатов,- обусловлен- . способа, поскольку ои паеволнет сократить ну о- влиянием .нестандартности пнтатель расходы sa определение биологической ных сред из природного сырья на резуль- активности токсина в условиях проиввоюр.: таты определения, поскольку на каждой стиа днфтерийного и гангренозного анаэ среде эа основу расчета степени ингнбн- >> оксню. I

Таблица 2

Экономический расчет определения биологической активности одной пробы токсина известным методом на лабораторных животных

Гангреназшай 12- баных 4 руб.- 87 коп. 48 час. токсин мышей

4 руб. 87коп.

Днфтернйный 1 мор 8 руб. 04 коп. 48 час. токсин скан

8 руб. 04 коп.

Таблица 3

Экономический расчет определения биологической. акт юности одной пробы токсина предлагаемым методом

Гангренозный токсин

19 коп. 40 час. 21 коп.

25 мл 2 коп.

Днфтернйный токсин

25 мл 2 кои.

19 коп. . 40 час. 21 коп.

Формула не обратessa -щий.ся тем,что, сцельЬопределення активности екзотоксинов микрооргаСпособ определеикя активности продул низмов рода клострндиум и рода корнне тов метаболизма микроорганизмов, вклю - бактериум, продукты метабощкика - экзо чающий посев тест-микроба в -odessa«osage. токсины смешивают с бульоном в соотдоэах в серию. робнрок с различными SS ношении 4 5-0,5:0,5-4,5, в качестве отношениями смеси нродуктов метаболиэ тес .микроба исшопьзуют штамм Е .Cote ма н бульона, экспозицию с последующей . КХ2; 200 PS, экспозицию проводят оценкой нх активности, о т-л и ч а ю - 68 ч, а актив«ость оценивают в относи

11 тельных едииипах иигибирования роста тесзм4ик роба е

Источники информапии, принятые во внимание при экспертизе

993947

1. Красильников Н.А. Методы изуч ния почвенных микроорганизмов и нх метаболитов. М., ИГУ, 1966„с. 152, 170 (прототип) .

993 947.

Составитель А. Макаров

Редактор Е. Хейфин Текред С.Мигунова Корректор Е. Рошко

Заказ 693/3 Тираж 711 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4