Штамм еsснеriснiа coli р-69-тест-культура для количественного определения @ -пролина в биоорганических смесях

 

О П И С А Н И Е < >996436

И ЗОБУЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советсиик

Социалистичесиин

Республик (6! ) Дополнительное к 38T.. саид-ву

3 (22) Заявлено 17.03.81. (2I ) 3260416/28-13 (5! ) М. Кл.

С 12 М 15/00 ф

С 12 P 13/24 с присоединением заявки №

Гесударствевве квинтвт (23) Приоритет

ceca ю делам нзейретнннй н нтнрмтнй (53) Ул К663 .18(088.8) Опубликовано 15.02.83. Бюллетень №6

Дата опубликования описания 15.02.83 (72) Авторы изобретения

М. Г. Оганесян и С. В. Кажоян

l г.„, Филиал Всесоюзного научно-исследовательско . «института генетики и селекции промышленных -. «АЙ@ .:; -,,

MHKpo0pl &HH3MoB (7!) Заявитель (54) ШТАММ i ESCHERICH1A СО 1 P 69 ТЕСТКУЛЬТУРА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ L -ПРОЛИНА В

БИООРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий — тест-культуры для количественного определения -пролина в различных питательных средах, культуральных жидкостях и различных органических смесях.

К штаммам тест-культурам для качественного и количественного определения аминокислот микробиологическим методом предъявляются следующие требования:

Штамм должен обладать высокой скоростью роста для обеспечения быстроты (непродолжительности) процесса определения количества данной аминокислоты; штамм должен быть высокочувствителен к изменениям концентрации orrpegeляемой аминокислоты для обеспечения высокой точности процесса определения количества данной аминокислоты; штамм не должен быть чувствителен к другим веществам, содержащимся в испытуемой пробе, для обеспечения гочности количественного определения дан ной аминокислоты независимо от присутствия в образпе пй:торонних пр ей. тим определяется широта областей при

5 менения штамма

3 штамм не должен быть патог.енным для человека и не должен вызывать кожные и аллергические реакции у персонала

1 штамм не должен быть спорообразую1о .щим, чтобы не разгрязнить лабораторные и производственные помещения посторонней для данного производства микро-флорой.

Известен штамм Й80 05(юга сгаь3 х используемый для микробиологического количественного определении l„-пролина 1).

Однако этот штамм не отвечает современным требованиям, предъявляемым к го тест-культурам, а именно скорость рост а штамма Йео .очрога

СгсВЬс очень низка, в результате чего™ продолжительность анализов достш.ает

200 ч. Культура Nevraspora c -а а

36 4 наступает, по уколу получают сероватобелый рост. Молоко свертывается, лакмусовое молоко розовеет и коогулируется. Непатогенен для человека и животных.

Штамм получат следующим образом.

Йля получения ауксотрофного по пролину, мутанта E. conj в качестве мутагенного фактора используют 1-метил 3-нитро-l-нитрозогуанидин, 5 мл культуры в логарифмической фазе роста дважды центрифугируют, ресуспендируют в 5 мл ацетатного буфера (pH-5,6), содержащего

60 мкг/мл нитрозогуанидина, и переносят в водяную баню при 37 С на 30 мин.

Обработанную суспензию отмывают от мутагена двукратным центрифугированием (40000 об/мин, 20 мин) и промыванием ,в буфере, после чего бактерии ресуспендируют в свежем мясо- пептонном бульоне и подращивают в течение 3-х ч при постоянном перемешивании для избавления от мутационных гетерозигот, высевают на мясо-пептонный агар из расчета около 100 клеток на каждую чашку Пето ри и инкубируют в термостате при 37 С в течение 1 сут.

Выросшие колонии пересевают на параллельные чашки с мясо-пептонным агаром и синтетической средой М9 следующего состава, r: МН, СР 1,0;

k4@ НР04 . 6,0; Кн 004 3,0;

М С 0,5; агар 11,0, вода 1000 мл.

Колонии, выросшие на мясо-пеп тонном агаре, но не выросшие на среде М9, пять раз пересевают на чашки с мясо-пептонным агаром, Выделенные таким образом и очищенные пятикратным пересевом культуры проверяют для установления потребности в факторах роста путем высева на чашки со средой М9 с добавлением аминокислот, витаминов и азотных оснований.

Из общей массы полученных ауксотрофных мутантов выделяли те, которые для своего роста нуждаются в добавлении в среду „-пролина.

В результате многократных проверок установлено, что полученный штамм

E. со@ P-69 строго специфичен и высо.ко чувствителен к L, -пролину и не реагирует на присутствие в среде других аминокислот.

Пример "L. (Определение содер, жания I„-пролина в синтетической среде N9 с помощью штамма E-соб P-69),Проводят испытание штамма P-69 для определения L, -пролина. Йля этого проверяют количество „-пролина, в синтетической среде М9, содержащей различ3 9964 обладает высокими протеолитическими свойствами, что делает его непригодным для анализа биоорганических смесей, имеющих в своем составе наряду со свободными аминокислотами белки, пептиды и r. u. keuroSpora crosscut or носится к спорообразуюшим микроорганизмам. Из- а своих малых размеров споры легко попадают в воздушную среду, вследствие чего они являются источником заг- О рязнения и нестерильности лабораторных и производственных помещений; Споровая культура может являться также фактором, вызывающим аллергическую реакцию у лабораторного и производственного персонала.

11елью изобретения является штамм бактерий, обладающий большей скоростью роста (l 8-20 ч) и чувствительностью к содержанию L, -пролина в среде и соз- 1 дающий возможность определения L -пролина в биоорганических смесях, а также более безвредного для персонала, вследствие необразования спор.

Полученный штамм Йеогospor сгазба

P-69, ауксотрофный по пролину, характеризуется следующими свойствами, Морфологические признаки. . Подвижная, грамотрицательная палочка, спор не образует. Размерь суточной культуры в мясном бульоне (1,2-1,6) мк; (0,6-0,8) мк. В условиях фазового контраста цитоплазма выглядит гомогенной с небольшими уплотнениями на концах клетки.

Культуральные признаки.

Хорошо растет на всех питательных средах (мясо-пептонный агар, агар на гидролизате рыбной пасты, среда Зндо), при инкубации на агаровых средах через

1 сут образует круглые, гладкие, бесцвет40 ные, плоские колонии с ровными краями. диаметр колоний — 1-суточной культуры

2-3 мм. Имеют мягкую консистенцию.

Легко обраЗует гомогенную суспензию.

На среде Эндо колонии окрашены в цвет фуксина, с металлическим блеском. На мясопептонном бульоне и других питательных жидких средах образует равномерную муть и небольшой осадок., Растет на синтетической среде М9 $© с добавкой 10-20 мкг/мл „-пролина.

Физиологические признаки.

Оптимальная температура для роста, 37 С, Оптимальная рН среды 7,0-7,4.

Расщепляет пактозу, глюкозу, мальтозу, $$ арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол и сероводород. Разжижения желатины не

$ 996436 i ные количества (-пролина. По резуль- N9, содержащую 10 мкг/мл L =пролитамм таких определений строится кривая на и инкубируют стационарно- в течение зависимости. оптической плотности расту-; 16 ч при 37о С. Титр культуры должен щего штамма от содержания проляна в достигнуть 1,0-5,0-10 .. Jj.o начала

9 образце. Кривая строится путем внесения $ определения культуру центрифугируюг иопределенного холйчества клеток шгамма ресуспендируют в стерильной минимальв качестве тест-культуры в пробирки, . ной среде. содержащие 1,- -пролин различной концент- Опытные пробирки с разведениями рации (0,1; 1,2, 5; 10; 20; 30; 40; иследуемых образцов -инокулируюг оп50; 100; 200; 500; мкг/мл). Пробы: lO редеденным количеством суспензии ин-, .инкубируют в течение 18-20 ч при,37еС, дикаторного штамма иэ расчета, чтобы после чего нефеломегрически определяют конечный титр культуры получался около характер зависимости оптической плотнос- 0,5 10 . Инкубируют в течение 20-

8 о ти (мутности суспензии выросшей тест- 22 ч при 37 C. Учет интенсивности рос культуры) от количества, -пролина в 1$ .та Е. со проводят фотометрированием. растворе. На чертеже представлено гра- Последующее определение содержания L -. фическое иэображение зависимости опт- пролина проводят по стандартной кривой. ческой плотности растущей E.co@ Р 69 Построение стандартной кривой. Для от концентрации L, -пролина. построения стандартной кривой в ряд

Наибольшая чувствительность кульгу- 2о пробирок с растворами различных концентры K Q -пролину наблюдается в пределах раций чистого l„-пролина (100, 50, 0,2-8 мк /мл 8MHHQKHczlorbI в cpege.. 20е 10з 5е 2, Хе э5 °, мкг/мл)

20 10 5 2 1 05 01 мкгмл л Пример 2. Определение (, про параллельно с опытными пробирками долина в ферментационных средах и культу„бавляюг определенное количество суспенральных жидкостях. $ Ьии индикаторного штамма. ИнкубируюгПодготовка анализируемых образцов. в течение 20-22 ч при 37 " С. ОпределеПробы культуральных жидкостей, а .также ние мутности проводят фотомегрированием, ферментационную среду стерелизуют в Растворы l„-пррлина готовят в минималь автоклаве в. течение 30 мин под давле- ной среде М9. Объем раствора в пробирнием 1 атм, отделяют центрифугировани- 30 ке 4 мл. Опыт ставит в трех повторносем от взвешенных частиц и микроорганиз- тях. По средним значениям мутности мов (4000 об/мин, 20 мин). С целью строят стандартную кривую зависимости окончательной очистки проб иадосадок оптической плотности от концентрации разводят.в минимальной среде М9 и ин- L, пролина в среде. (чертеж). кубируют в кипящей. водяной. бане. Появив-$$ На чертеже изображена кривая для шуюся после обработки муть осаждают определения количества L, -ïðoëèíà с повторным центрвфугированием. Получен-. помошью тест-культуры Е. со Ei P-69, ный таким образом недостаток в зави- где на оси абсцисс отражена оптическая симости or ожидаемой концентрации L, — плотность, а на оси ординат — концентра-: пролина разводят в соответствующее чис- р ция l„--пролина в мг/мл. ло раз в минимальной среде М9, следую- Пример 3. Использование шгам щего состава, г: gHpC0 1; Йа НРО - . ма E,соЬ Р-69 для определения кон-! 6; KHg P0q 3; Мс М 5; вода — Х л. центрации L пролина в компонентах

Разведения подбираются так, чтобы содер- ферментационных:сред: гидролизате BBK жанне аминокислоты укладывалось в стан-4$. (белково-витаминный концентрат) и ме- даргную кривую. лассе.

Определение ведут в стандартных про- Различные партии EBK и мелассы огбирках, в которые разливают по 4 мл ми- личаются содержанием аминокислот, в нимальной среды.. В;первую пробирку вно- том числе и. пролина. Для стабилизации сят 1 мл испытуемой. пробы н после . состава ферментационных сред необхоФ тщательного перемешивания 1 млперено- димо жать точное количество амияокиссят во вторую пробирку и т. д. Из пос-. лот, так как в некоторох случаях их ледней пробирки 1 мл жидкости отбра- недостаточное количество или излишек сывают. Каждое разведение берут в трех влияет HB выход конечного продукта ферповторнос гях. ментации.

Подготовка индикаторной культуры.

$$

Цля определения количества пролина

Ауксотрофную по пролину культуру E..G06 гидролизат BBK стерилизуюг в автоклаР-69, выращенную в 2 мл питательного,, ве (1 атм, 30 мин), разводят в мнни- . бульона, переносят в минимальную среду мальной среде М9 в определенное колиpf

0ф

4 ц Ф

<0,2

Ф

fu 8u цг ти

Мнц f яцик I- р и//а, // нп

ВНИИПИ Заказ 844/37 Тираж 521 Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул.Проектная, 4

7 9964 чество раз (5, 10, 20 раз и т. д.) и инокулируют предварительно подготовлен HoN культурой.

Пробирки инкубипуют стационарно в термостате при 37 С в течение 18-2О ч.g

Величины оптических плотностей после фотометрирования откладывают на стан дартной кривой и определяют количество пролина в пробах.

При определении содержания пролина lo в мелассе навеску мелассы предваритель но разводят в минимальной среде (25 раз), стерилизуют, центрифугируют и далее разводят (в 50, 100, 125 и более раз) в зависимости от ожидаемой концентрации 1$ пролина.

Пример 4. Определение содержания пролина в моче.

При определении содержания пролина в

Моче, последнюю инкубируют в кипящей рр водяной бане в течение 40 мин для осаждения взвешенных частиц и заражают индикаторной культурой F, Cori Р-69.

Ответную реакцию тест-культуры на наличие в пробах пролина определяютфото-.. 2g метрированием после 18-20 ч роста, Количество аминокислоты определяют по стандартной кривой.

36 8

Чинимальная доза пролина, при которой наблюдается рост индикаторной культуры E. со1 P-69 — 0,2 мкг/мл. В диапазоне концентраций пролина 0,2-

8,0 мкг/мл интенсивность роста культуpbl пропорциональна количеству мого вещества в среде.

Предложенный штамм $5cher ictt1o

cori P-69, ауксотрофный по пролину, обладает большой скоростью роста и чувствительностью к содержанию L, -пролнна в пробе и создает возможность определения

L -пролина в различных биоорганических смесях.

Формула изобретения

Штамм ГБСЙЕгiC8ia СО6 P 69 (коллекция Музея культуры промышленных микроорганизмов филиала института

ВНИИгенетика", коллекционный номер

ТК-691) — тест-культура для количественного определения „ -npomma в биоорганических смесях.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Brand etal, f945, J. Amer. chem.

Soc., 67, 1524.