Способ получения нуклеазы

 

:, 1 1 1 Фъ л « (72) Автвры изобретения

А. А. Зейдака, Л. А. Орна, А. А. Ииериня (71) Заявмтель

t (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕАЗЫ 5.1

Изобретение относится к способам получения нуклеазы S< (ЕС 3. 1.4. 21 )-. .Ф одноцепочной ну клеат-5-олигону клео-, тид гидролазы, применяемой в молеку- лярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты и строения рибосомальной, транспортной и вирусной рибонуклеиновой кислоты, в генетической инженерии для получения рекомбинатных молеl f кул и при получении 5-рибо- и 5-дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеиновой кислоты и денатурированной дезок.сирибонуклеиновой кислоты.

fS

Известен. способ получения нуклеаw S из вмилоризина путем термообработки при 70вС, высаливания сульфатом аммония (70-100 степень насыщения}, диализа и хроматографии на сульфосефадексе GO-50 при рН 3,8 и на сефадексе 6-75. Достигаемый вы; ход нуклеазы S<163 при удельной активности 450 ед/мг 13..

Однако способ имеет недостаточную высокую активность фермента, необходимость двукратной хроматографии, осложняющей процесс.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения нуклеазы S включающий экстрагирование такадиастазы, осаждение сульфатом аммония до насыщения 60-903 диализ, хроматографию на диэтиламино-. этилцеллюлозе, уравновешенной 0,01 И фосфатным буфером рН 7,0 ступенчатое элюирование, при этом используют 0,01 И калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,05 И натрия хлористый в 0,01 И фосфатном буфере, 0,02 И калий фосфорнокислый однозамещенный и

0,01 И натрий хлористый в 0,01 И фосфатном буфере:,0,04 И калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,2 И натрий хлористый и 0,01 И фосфатном буфере, 0,04 И калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,5 И натрий хлооис2 4

5,7 и добавляют сульфат аммония до

0,65-0,95 насыщения, осадок отделяют центрифугированием и растцоряют в растворе ацетата аммония рН 5,05,5, содержащего ионы цинка, диализуют и. наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой, уравновешенную раствором ацетата аммония рН 5,0-5,5, содержащим ионы цинка. Элюцию проводят линейным градиентом ацетата аммония от 0,02 до 0,5 M. Фракции, содержащие нуклеазу S объединяют. Полученная нуклеаза,S является гомогенным белком при электрофорезе в полиакриламидном геле и не содержит примесей других Ферментов, расщепляющих рибонуклеиновую кислоту и нативную дезоксирибонуклеиновую кислоту.

Пример . Культуральную жидкость Asp. oryzae 3-9-15 (500мл), выраженную на питательной среде, содер.— жащей ионы цинка с нуклеазной активностью 220 ед/мл подкисляют до рН 5,7 и добавляют сульфат аммония до насыщения 65"0, центрифугируют

40 мин при 4500 об/мин. К центрифугу добавляют сульфат аммония до насыщения 95l и оставляют на 1520 ч. Раствор центрифугируют 1 ч при 9000 об/мин и полученный осадок растворяют в 0,02 М растворе ацетата аммония, содержащего 0,1 М ионов цинка и диализируют против 0,02 М раствора ацетата аммония, содержащего

0,1 М ионов цинка. Наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозной (2х30 см), уравновешенной 0,02 M раствором уксуснокислого аммония, содержащего 0,1 мМ ионов цинка и элюируют градиентом от 0,02 И до 0,5 М раствора аммония уксуснокислого, содержащего 0,1 мМ ионов цинка. Фракции, содержащие нуклеазу Я.! объединяют.

3 99850 тый в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,0, Нуклеаза S элюируется 0,04 И калием фосфорнокйслым однозамещенным и

0,2 М.натрием хлористым в 0,01 И фосфатном буфере рН 7,0, после че! о про-s водят гельхроматографию на сефадексе G-75, Получают препарат нуклеазы S активность 18425 ед/мг белка, выход .34, степень очистки 10000 раз (2 ).

Однако известный способ имеет сравнительно низкое качество полученного

- препарата (имеются примеси рибонуклеаз Т и Т, фосфодиэстераз, ферментов, расщепляющих нативную дезоксири- 1З бонуклеиновую,кислоту). Сложность процесса -.повторная очистка препарата .гельхроматографией на сефадексе G-75.

Целью изобретения является повышение активности и качества нуклеазы щ

S (под повышением качества понима1 ют отсутствие примесей сопутствующих ферментов).

Поставленная цель достигается способом получения нуклеазы S1 на осно- 25 ве продуцента Aspeegillus oryzae, включающим фракционированное осаждение белков сульфатом аммония и выделение нуклеазы Ь хроматографией на диэтиламиноэтил-целлюлозе, причем зв в -качестве источника нуклеазы S используют культуральную жидкость.

Aspergillus oryzae 3-9-15, полученную при культивировании на питательной среде, обогащенной сульфатом цинка в количестве 0,05-0,07 вес.3, фракционированное осаждение осуществляют при степени насыщения культураль-. ной жидкости сульфатом аммония

0,65-0.,95, а. хроматографию проводят при рН 5,0-5,5 в среде ацетата аммония, содержащего 0,1-1 мИ ионов цинка, с элюцией линейным градиентом указанного .растВора ацетата аммония в пределах концентраций 0,0205М °

Способ осуществляют следующим образом.

Культуральную жидкость Asp. ory-:

zae, выращенную на известной. питательной среде (3 ), обогащенной сернокислым цинком, и обладающую нуклеазной активностью, подкисляют до рН

Результаты очистки приведены в. табл.1.

В результате получают 110 мл фер ментного раствора, активность

23,300 ед/мг белка, выход 23 по активности, степень очистки 160 раз (табл. 1) .

99S502

1

I

I

I

Я

Щ а

° О

I

1 ф

1 C

1 Э

1 !! о

Ю

1 о о х ф

X б1

X бб О

t4 о х о

1

1 е

Y а с

Ю

CD б О

I ..Å О ! х.z

О ф

I—

>s Cf

ХЭ!

1, о

1 !о о х ! ClI

f X !

1 ф

Ф

О о .о

Ю

CD

l Ch.

1 е ! X

Сп

ЬЮ

Ю

Ъа Y бб CO

Y 1 о (Ю

Ю б,11

«

Ю

Ю с

Э ба

1 !

I

f

I !

-1

I

I . I

1 .I

I

>х

il

CL

СМ

Ю! « о с юб

1!

1

I

I

I !

Э

IO

Ю бЧ

CD .

CD

CD

3.Л

С Ъ

< бЛ

Я

-Ф мъ

К X

1 ф о о й!

1

1 ! ! !

1 !

1 .( б !

1 !

1 !

1

1

I .1

f о о

CII

=Г о а с эх

X х о

Ol - . з

I о о с х х

Э

IЛ Э 1 ф \Q 1 е . 1

Э.L I

О

Iо о

Cf х

C

fII х с е а

«ъ

О с

Ъь

Ю Ю

4Ч

О, е4 х о

X

E мъ оm

1 е LA

& 0

О с x

W X

v z

Э

X Л

Z O

Р* е х

v а о с

7 . 998502 8

Определение активности нуклеазы Ь1,, до 23.300 ед/мг белка и выхода по

Активность нуклеазы S< определяют по активности 253 Упрощается процесс расщеплению ферментом денатурирован- выделения фермента, так как исклюной ДНК при рН 4,6. чается дополнительная очистка на сеЗа единицу активности принима- э фадексе Г-75. ется количество фермента, которое Для характеристики качества прегидролизует I мг денатурированной паратов нуклеазы 5„ определялись акдезоксирибонуклвиновой кислоты за

0 тивность фермента активность на напри 37 C v pH 4э6° . тивную ДНК, кислая и щелочная фос-

Технико-экономический эффект пред-1в фодиэстераза и кислая и щелочлагаемого изобретения заключается ная фосфомоноэкстераза в повышении активности нуклеазы S Результаты приведены в табл,2.

Таблица 2

Фермент Показатели

Величина активности

Удельная активность, ед/мг белка

Нуклеаэа 5.1

23 300

Удельная активность примесей расщепляющих нативную ДНК,4

0,21 фосфомоноэстераза (кислая), ед/мг белка

0,02 фосфомоноэстераза (щелочная1 ед/мг белка

0,003

Фосфодиэстераза (кислая1,ед/мг белка

Фосфодиэстераза (щелочная),ед/мг белка 0

ВНИИПИ Заказ 1074/45 Тираж 521 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул, Проектная, 4

Результаты показали, что нуклеа за 5„ содержит только 0,24 ДНК - азы и практически не содержит примесей.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в превышении активности нуклеазы S . и ее качества.

Формула изобретения

Способ получения нуклеазы S< íà основе продуцента Aspergillus oryzae, включающий фракционированное осажде<5 ние белков сульфатом аммония и выделение нуклеаэы 5„хроматографией на дцэтиламиноэтил-целлюлозе, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения активности получаемого фер" мента и улучшения его качества, в

50 качестве источника нуклеаэы Ь„используют культуральную жидкость Aspergil lus oryzae 3-9-15, полученную при культивировании на питательной среде, обогащенной сульфатом цинка в количестве 0,05-0,07 вес.4 фракционированное осаждение осуществляют при степени насыщения культуральной жидкости сульфатом аммония 0,650,95, а хроматографию проводят при рН 5,0-5,5 в среде ацетата аммония, содержащего 0,1-1 мИ ионов цинка, с элюцией линейным градиентом указанного раствора ацетата аммония в пределах концентраций 0,02-0,5 M.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Сенченко В. Н. и др. Получение и некоторые характеристики функционально-гомогенного препарата нуклеазы S< иэ амилориэина. "Молекулярная бйология", 1979, т. l3, 6, с. 1377-1383.

2 ° J. Ando Biochim, Biophys, Acta

1966 144, 158-168.

Авторское свидетельство СССР

N 328746, кл. С 12 и 9/28, 1970.