Композиции и способы для биологического получения изопрена - заявка 2015131480 на патент на изобретение в РФ

1. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения, содержащая экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую изопренсинтазу, при этом указанная метанотрофная бактерия способна превращать углеродное сырье в изопрен.
2. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п.1, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота, кодирующая указанную изопренсинтазу, получена из Populus alba, Populus trichocarpa, Populus tremuloides, Populus nigra, Populus alba×Populus tremula, Populus×canescens, Pueraria montana, Pueraria lobata, Quercus robur, Faboideae, Salix discolor, Salix glabra, Salix pentandra или Salix serpyllifolia.
3. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 1, отличающаяся тем, что последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующая указанную изопренсинтазу, оптимизирована по кодонам для экспрессии в указанной метанотрофной бактерии.
4. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 1, отличающаяся тем, что указанная изопренсинтаза не содержит N-концевой последовательности, направляющей белок в пластиды.
5. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 2, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-6.
6. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 2, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 14-19.
7. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 1, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая изопренсинтазу, функционально связана с последовательностью, контролирующей экспрессию.
8. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 7, отличающаяся тем, что указанная последовательность, контролирующая экспрессию, представляет собой промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора метанолдегидрогеназы, промотора гексулозо-6-фосфатсинтазы, промотора белка S16 рибосомы, промотора серингидроксиметилтрансферазы, промотора серинглиоксилатаминотрансферазы, промотора фосфоенолпируваткарбоксилазы, промотора Т5 и промотора Trc.
9. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 1, отличающаяся тем, что указанная метанотрофная бактерия способна сверхэкспрессировать эндогенный фермент DXP-пути по сравнению с нормальным уровнем экспрессии указанного эндогенного фермента DXP-пути исходной метанотрофной бактерией, трансформирована экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент DXP-пути, и способна экспрессировать экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент DXP-пути, или может характеризоваться и тем, и другим одновременно.
10. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 1, отличающаяся тем, что указанная метанотрофная бактерия способна сверхэкспрессировать эндогенный фермент мевалонатного пути по сравнению с нормальным уровнем экспрессии указанного эндогенного фермента мевалонатного пути исходной метанотрофной бактерией, трансформирована экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент мевалонатного пути, и способна экспрессировать экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент мевалонатного пути, или может характеризоваться и тем, и другим одновременно.
11. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения п. 9, отличающаяся тем, что указанный фермент DXP-пути представляет собой DXS, DXR, IDI, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH или их комбинацию.
12. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения п. 10, отличающаяся тем, что указанный фермент мевалонатного пути представляет собой ацетоацетил-КоА-тиолазу, 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-синтазу, 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазу, мевалонаткиназу, фосфомевалонаткиназу, мевалонатпирофосфатдекарбоксилазу, изопентенилдифосфатизомеразу или их комбинацию.
13. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по любому из пп. 1-12, отличающаяся тем, что указанная метанотрофная бактерия трансформирована по меньшей мере одной экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант фермента DXP-пути.
14. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по п. 13, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один вариант ферментов DXP-пути включает два варианта ферментов DXP-пути, при этом указанные два варианта ферментов DXP-пути включают мутантную пируватдегидрогеназу (PDH) и мутантную 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу (DHBPS).
15. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по любому из пп. 1-12 или 14, отличающаяся тем, что указанная метанотрофная бактерия способна производить от приблизительно 1 мг/л до приблизительно 500 г/л изопрена.
16. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по любому из пп. 1-12 или 14, отличающаяся тем, что указанная метанотрофная бактерия представляет собой Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methanomonas, Methylocella, Methylocapsa.
17. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения любому из пп. 1-12 или 14, отличающаяся тем, что указанная метанотрофная бактерия представляет собой Methylococcus capsulatus штамм Bath, Methylomonas methanica 16a (АТСС РТА 2402), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11,196), Methylosinus sporium (NRRL B-11,197), Methylocystis parvus (NRRL B-11,198), Methylomonas methanica (NRRL B-11,199), Methylomonas albus (NRRL B-11,200), Methylobacter capsulatus (NRRL B-11,201), Methylobacterium organophilum (ATCC 27,886), Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400), Methylocella silvestris, Methylocella palustris (ATCC 700799), Methylocella tundrae, Methylocystis daltona штамм SB2, Methylocystis bryophila, Methylocapsa aurea KYG, Methylacidiphilum infernorum, Methylacidiphilum fumariolicum, Methyloacida kamchatkensis, Methylibium petroleiphilum или Methylomicrobium alcaliphilum.
18. Метанотрофная бактерия неприродного происхождения по любому из пп. 1-12 или 14, отличающаяся тем, что указанное углеродное сырье представляет собой метан, метанол, природный газ или природный газ нетипичного происхождения.
19. Способ получения изопрена, включающий культивирование метанотрофной бактерии неприродного происхождения, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую изопренсинтазу, в присутствии углеродного сырья в условиях, достаточных для получения изопрена.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанная нуклеиновая кислота, кодирующая изопренсинтазу, получена из Populus alba, Populus trichocarpa, Populus tremuloides, Populus nigra, Populus alba×Populus tremula, Populus×canescens, Pueraria montana, Pueraria lobata, Quercus robur, Faboideae, Salix discolor, Salix glabra, Salix pentandra или Salix serpyllifolia.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанная последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующая указанную изопренсинтазу, оптимизирована по кодонам для экспрессии в метанотрофной бактерии-хозяине.
22. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанную изопренсинтазу, не содержит N-концевой последовательности, направляющей белок в пластиды.
23. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-6.
24. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 14-19.
25. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая изопренсинтазу, функционально связана с последовательностью, контролирующей экспрессию.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанная последовательность, контролирующая экспрессию, представляет собой промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора метанолдегидрогеназы, промотора гексулозо-6-фосфатсинтазы, промотора белка S16 рибосомы, промотора Т5 и промотора Trc.
27. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанная метанотрофная бактерия способна сверхэкспрессировать эндогенный фермент DXP-пути по сравнению с нормальным уровнем экспрессии указанного эндогенного фермента DXP-пути исходной метанотрофной бактерией, трансформирована экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент DXP-пути, и способна экспрессировать экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент DXP-пути, или может характеризоваться и тем, и другим одновременно.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанный фермент DXP-пути представляет собой DXS, DXR, IDI, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH или их комбинацию.
29. Способ по любому из пп. 19-21, 26-28, отличающийся тем, что указанная метанотрофная бактерия трансформирована по меньшей мере одной экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант фермента DXP-пути.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один вариант фермента DXP-пути включает два варианта ферментов DXP-пути, при этом указанные два варианта ферментов DXP-пути включают мутантную пируватдегидрогеназу (PDH) и мутантную 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу (DHBPS).
31. Способ по любому из пп. 19-21, 26-28 или 30, отличающийся тем, что указанная метанотрофная бактерия представляет собой Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methanomonas, Methylocella, Methylocapsa.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанная метанотрофная бактерия представляет собой Methylococcus capsulatus штамм Bath, Methylomonas methanica 16a (ATCC РТА 2402), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11,196), Methylosinus sporium (NRRL B-11,197), Methylocystis parvus (NRRL B-11,198), Methylomonas methanica (NRRL B-11,199), Methylomonas albus (NRRL B-11,200), Methylobacter capsulatus (NRRL B-11,201), Methylobacterium organophilum (ATCC 27,886), Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400), Methylocella silvestris, Methylocella palustris (ATCC 700799), Methylocella tundrae, Methylocystis daltona штамм SB2, Methylocystis bryophila, Methylocapsa aurea KYG, Methylacidiphilum infernorum, Methylacidiphilum fumariolicum, Methyloacida kamchatkensis, Methylibium petroleiphilum или Methylomicrobium alcaliphilum.
33. Способ по любому из пп. 19-21, 26-28, 30 или 32, отличающийся тем, что указанное углеродное сырье представляет собой метан, метанол, природный газ или природный газ нетипичного происхождения.
34. Способ по любому из пп. 19-21, 26-28, 30 или 32, отличающийся тем, что указанная метанотрофная бактерия способна производить от приблизительно 1 г/л до приблизительно 500 г/л изопрена.
35. Способ по любому из пп. 19-21, 26-28, 30 или 32, отличающийся тем, что указанную метанотрофную бактерию культивируют путем ферментации, и изопрен, полученный в результате ферментации, выделяют в виде отходящего газа.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанный выделенный изопрен далее модифицируют с образованием димерных (10-углеродных) углеводородов, тримерных (15-углеродных) углеводородов или их комбинации.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что указанный димерный углеводород, тримерный углеводород или их комбинацию подвергают гидрогенизации с образованием длинноцепочечных разветвленных алканов.
38. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанный выделенный изопрен далее модифицируют с образованием изопреноидного продукта.
39. Способ скрининга мутантных метанотрофных бактерий, включающий:
a. воздействие мутагена на метанотрофные бактерии с получением мутантных метанотрофных бактерий;
b. трансформацию указанных мутантных метанотрофных бактерий экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей геранилгеранилдифосфатсинтазу (GGPPS), фитоинсинтазу (CRTB) и фитоиндегидрогеназу (CRTI); и
c. культивирование указанных трансформированных мутантных метанотрофных бактерий в условиях, достаточных для размножения;
причем увеличение красной пигментации у мутантной метанотрофной бактерии по сравнению с эталонной метанотрофной бактерией, содержащей экзогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие GGPPS, CRTB и CRTI, указывает на увеличение синтеза предшественника изопрена.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанный мутаген представляет собой облучение, химическое вещество, плазмиду или транспозон.
41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что этап (b) осуществляют перед этапом (a), и затем указанные трансформированные мутантные метанотрофные бактерии культивируют в условиях, достаточных для размножения.
42. Способ по любому из пп. 39-41, отличающийся тем, что указанная мутантная метанотрофная бактерия с увеличенной красной пигментацией или ее клональная клетка трансформирована экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей изопренсинтазу.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что в указанной мутантной метанотрофной бактерии по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот, кодирующих GGPPS, CRTB и CRTI, удалена или инактивирована.
44. Способ скрининга генов пути изопрена у метанотрофных бактерий, включающий:
a. трансформацию метанотрофных бактерий:
(I) по меньшей мере одной экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент пути изопрена;
(II) экзогенными нуклеиновыми кислотами, кодирующими геранилгеранилдифосфатсинтазу (GGPPS), фитоинсинтазу (CRTB), и фитоиндегидрогеназу (CRTI); и
b. культивирование указанных метанотрофных бактерий со стадии (а) в условиях, достаточных для размножения;
причем увеличение красной пигментации у трансформированной метанотрофной бактерии по сравнению с эталонной метанотрофной бактерией, содержащей экзогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие GGPPS, CRTB и CRTI, и не содержащей экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент пути изопрена, указывает на увеличение синтеза предшественника изопрена.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что указанный фермент пути изопрена представляет собой фермент DXP-пути или фермент мевалонатного пути.
46. Способ по п. 44, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент пути изопрена, представляет собой гетерологичную нуклеиновую кислоту.
47. Способ по любому из пп. 44-46, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент пути изопрена, оптимизирована по кодонам для экспрессии в указанных метанотрофных бактериях-хозяевах.
48. Способ по п. 44 или 45, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент пути изопрена, представляет собой гомологичную нуклеиновую кислоту.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанная гомологичная нуклеиновая кислота сверхэкспрессированна в указанных метанотрофных бактериях.
50. Способ по любому из пп. 44-46 или 49, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент пути биосинтеза изопрена, представляет собой неприродный вариант.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что указанный неприродный вариант получают с помощью случайного мутагенеза, сайт-направленного мутагенеза или их комбинации.
52. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанный неприродный вариант является синтезированным.
53. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанный неприродный вариант содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с референсной нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент пути изопрена.
54. Композиция изопрена, в которой указанный изопрен имеет распределение δ13С менее чем приблизительно .
55. Композиция изопрена по п. 54, в которой указанный изопрен имеет распределение δ13С менее чем приблизительно .
56. Композиция изопрена п. 54, в которой указанный изопрен имеет распределение δ13С менее чем приблизительно .
57. Композиция изопрена п. 54, в которой указанный изопрен имеет распределение δ13С, находящееся в диапазоне от приблизительно до приблизительно .
58. Композиция изопрена по п. 54, в которой указанный изопрен имеет распределение δ13С, находящееся в диапазоне от приблизительно до приблизительно .
59. Композиция изопрена по п. 54, в которой указанный изопрен имеет распределение δ13С, находящееся в диапазоне от приблизительно до приблизительно .
Наверх