Слитые иммуномодулирующие белки и способы их получения - заявка 2015140608 на патент на изобретение в РФ

1. Способ получения терапевтически активного слитого белка, содержащего группировку направленного взаимодействия с опухолью и по меньшей мере одну иммуномодулирующую молекулу, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, связывающееся с CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов) или EGFR1 (рецептор эпидермального фактора роста 1), и где слитый белок получают осуществлением следующих стадий:
получение кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность для антитела лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на С-конце тяжелых цепей антитела;
клонирование оптимизированной последовательности указанного слитого белка в клетке-хозяине, способной к транзиентной или стабильной экспрессии;
выращивание клетки-хозяина в среде в условиях, подходящих для выращивания и обеспечения клетке-хозяину возможности экспрессировать слитый белок; и
сбор секретированных слитых белков, возможно, для дальнейшей очистки.
2. Способ по п. 1, где иммуномодулирующая молекула противодействует иммунной толерантности раковой клетки.
3. Способ по п. 1, где иммуномодулирующая молекула связана с антителом посредством аминокислотной последовательности, длина которой достаточна для обеспечения возможности биспецифического связывания слитого белка.
4. Способ по п. 1, где иммуномодулирующая молекула связана непосредственно или через линкер с тяжелой цепью антитела, легкой цепью антитела или обеими цепями.
5. Способ по п. 1, где иммуномодулирующая молекула связана непосредственно или через линкер с N- или С-концом тяжелой цепи антитела, N- или С-концом легкой цепи антитела либо как N-, так и С-концом обеих цепей.
6. Способ по п. 1, где иммуномодулирующая молекула связывается с (1) трансформирующим фактором роста бета (TGF-β) и/или (2) лигандом 1 запрограммированной гибели-1 (PD-L1).
7. Способ по п. 1, где антитело связывается с EGFR1, а иммуномодулирующая группировка связывается с трансформирующим фактором роста бета (TGF-β).
8. Способ по п. 7, где кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 1, 2, 4 и 7.
9. Способ по п. 1, где антитело связывается с EGFR1, а иммуномодулирующая группировка связывается с PD-1L.
10. Способ по п. 9, где кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4.
11. Способ по п. 1, где антитело связывается с CTLA4, а иммуномодулирующая группировка связывается с PD-1L.
12. Способ по п. 11, где кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 5, 6, 3 и 4.
13. Препарат, содержащий гомогенные терапевтически активные слитые белки, содержащие группировку направленного взаимодействия с опухолью и по меньшей мере одну иммуномодулирующую молекулу, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, связывающееся с CTLA-4 или EGFR1, и где слитые белки получены осуществлением следующих стадий:
получение кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, где кодон-оптимизированная последовательность для антитела лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на С-конце тяжелых цепей антитела;
клонирование кодон-оптимизированной последовательности указанного слитого белка в клетке-хозяине, способной к транзиентной или стабильной экспрессии;
выращивание клетки-хозяина в среде в условиях, подходящих для выращивания и обеспечения клетке-хозяину возможности экспрессировать слитый белок; и
сбор секретированных слитых белков для возможной очистки.
14. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный слитый белок, содержащий по меньшей мере одну группировку направленного взаимодействия с опухолью, обладающую аффинностью в отношении раковой клетки, и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности раковой клетки, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, и последовательность нуклеиновой кислоты антитела лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на С-конце тяжелых цепей антитела.
15. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 14, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь антитела, выбрана из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5.
16. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 14, где последовательность нуклеиновой кислоты для химерного слитого белка содержит SEQ ID NO: 1, 2, 4 и 7.
17. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 14, где последовательность нуклеиновой кислоты для химерного слитого белка содержит SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4.
18. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 14, где последовательность нуклеиновой кислоты для химерного слитого белка содержит SEQ ID NO: 5, 6, 3 и 4.
19. Вектор, содержащий оптимизированные гены, для лечения рака у субъекта-человека, где оптимизированные гены модифицированы для увеличения содержания последовательностей CG, где вектор содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере одну группировку направленного взаимодействия, по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку и связывающую группировку, где оптимизированные нуклеотидные последовательности выбраны из SEQ ID NO: 1-7.
20. Вектор по п. 19, где нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 1,2, 4 и 7.
21. Вектор по п. 19, где нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 1,2, 3 и 4.
22. Вектор по п. 19, где нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 5, 6, 3 и 4.
23. Способ лечения рака у субъекта, включающий:
а) получение терапевтически активного слитого белка, содержащего группировку направленного взаимодействия с опухолью и по меньшей мере одну иммуномодулирующую молекулу, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, связывающееся с CTLA-4 или EGFR1, и где слитый белок получают осуществлением следующих стадий:
1) получение кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность для антитела лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на С-конце тяжелых цепей антитела;
2) клонирование оптимизированной последовательности указанного слитого белка в клетке-хозяине, способной к транзиентной или стабильной экспрессии;
3) выращивание клетки-хозяина в среде в условиях, подходящих для выращивания и обеспечения клетке-хозяину возможности экспрессировать слитый белок; и
4) сбор секретированных слитых белков для возможной очистки;
б) введение субъекту терапевтически активного количества слитых белков.
24. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 15 и 9.
25. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и 16.
26. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17 и 9.
27. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и 18.
28. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 27 и 9.
29. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и 28.
30. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 29 и 9.
31. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и 30.
32. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31 и 28.
33. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 31 и 30.
34. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 29 и 28.
35. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 29 и 30.
36. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32 и 14.
37. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13 и 33.
38. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и 14.
39. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13 и 35.
40. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32 и 33.
41. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32 и 35.
42. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и 33.
43. Способ по п. 23, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и 35.
Наверх