Синтетические промоторы - заявка 2016125744 на патент на изобретение в РФ

1. Клетка CHO, содержащая синтетический промотор, подходящий для активации экспрессии рекомбинантного белка в ней, где указанный синтетический промотор содержит ядро промотора и выше него два или более регуляторных элементов фактора транскрипции, независимо выбранных из группы, состоящей из NFκB-RE, E-box, AP1, CRE, GC-Box, E41F, C/EBPα-RE, OCT и RARE.
2. Клетка CHO по п. 1, где ядро промотора выбрано из CMV, SV40, UbC, EF1A, PGK и CAGG, такого как ядро CMV, в частности ядро hCMV-IE1 (SEQ ID NO:170).
3. Клетка CHO по п. 1 или 2, где синтетический промотор содержит от 2 до 50 регуляторных элементов фактора транскрипции, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, например, 5, 6, 7 или 8 указанных регуляторных элементов.
4. Клетка CHO по любому из пп. 1-3, где регуляторные элементы фактора транскрипции являются все одного типа.
5. Клетка CHO по любому из пп. 1-3, где регуляторные элементы фактора транскрипции представляют собой комбинацию различных типов.
6. Клетка CHO по любому из пп. 1-5, где регуляторные элементы фактора транскрипции располагаются в паре.
7. Клетка CHO по п. 5, где каждый регуляторный элемент фактора транскрипции в комбинации независимо выбран из NFκB-RE, E-box, GC-Box, C/EBPα-RE, CRE и E41F, в частности выбран из NFκB-RE, E-box, GC-Box и C/EBPα-RE, особенно из NFκB-RE, и E-box, в частности 2 или более копий по меньшей мере одного регуляторного элемента в комбинации.
8. Клетка CHO по любому из пп. 1-7, где последовательность ДНК синтетического промотора составляет 0,9 или менее размера полноразмерной последовательности промотора CMV, например, 0,8, 0,75, 0,7, 0,6, 0,5 или менее.
9. Клетка CHO по любому из пп. 1-8, где синтетический промотор обладает транскрипционной активностью на единицу последовательности ДНК, которая является больше чем транскрипционная активность на единицу ДНК промотора CMV, например, увеличение активности в 1,2, 1,4, 1,5, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4 или 2,5 раз.
10. Клетка CHO по любому из пп. 1-9, где клетка CHO выбрана из CHO-S, CHO-K1 и CHO-DG44.
11. Клетка CHO по любому из пп. 1-10, где активность регуляторного элемента фактора транскрипции YY1 ингибируют, например, блоком-ловушкой, специфической к YY1, или где клетку подвергают мутации для удаления фактора транскрипции YY1, и/или чтобы сделать его молчащим, таким образом, ингибируя активность YY1.
12. Клетка CHO по любому из пп. 1-11, где клетка дополнительно содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок под контролем синтетического промотора.
13. Клетка CHO по п. 12, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
14. Клетка CHO по любому из пп. 1-13, где промотор обладает улучшенной экспрессией белка по сравнению с ядром промотора или промотором дикого типа.
15. Клетка CHO по п. 14, где улучшенная экспрессия белка представляет собой более высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка.
16. Клетка CHO по любому из пп. 1-15, где синтетический промотор содержит последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO:30-169.
17. Клетка CHO по п. 16, где синтетический промотор содержит последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO:126-169.
18. Клетка CHO по п. 16, где синтетический промотор содержит нуклеотидную последовательность, проведенную в SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128 или SEQ ID NO:144.
19. Клетка CHO по любому из предшествующих пунктов, где синтетический промотор не содержит какие-либо CpG-островки.
20. Клетка CHO по любому из пп. 1-19, где синтетический промотор обладает свойствами, подходящими для экспрессии конкретного рекомбинантного белка, с которым он связан.
21. Синтетический промотор, подходящий для активации экспрессии рекомбинантного белка в клетке CHO, где указанный синтетический промотор содержит ядро промотора и выше него смесь двух или более регуляторных элементов фактора транскрипции, независимо выбранных из группы, состоящей из NFκB-RE, E-box, AP1, CRE, GC-Box, E41F, C/EBPα-RE, OCT и RARE, в частности 2 или более копий по меньшей мере одного регуляторного элемента в комбинации.
22. Синтетический промотор, подходящий для активации экспрессии рекомбинантного белка в клетке CHO, где указанный синтетический промотор содержит ядро промотора и выше него смесь двух или более регуляторных элементов фактора транскрипции, независимо выбранных из группы, содержащей или состоящей из NFκB-RE и CRE.
23. Способ получения синтетического промотора, подходящего для активации экспрессии рекомбинантного белка в данной рекомбинантной клетке-хозяине млекопитающего, включающий этапы:
a) идентификации мотивов регуляторных элементов фактора транскрипции,
b) тестирования каждого регуляторного элемента фактора транскрипции, идентифицированного на этапе a), в комбинации с ядром промотора на активность в выбранной линии рекомбинантных клеток-хозяев млекопитающего,
c) отбора двух или более регуляторных элементов фактора транскрипции после этапа (b), которые являются более активными в выбранной рекомбинантной линии клеток-хозяев млекопитающего, чем одно ядро промотора,
d) получения одной или более конструкций синтетического промотора, содержащей два или более таких регуляторных элементов фактора транскрипции, независимо выбранных из регуляторных элементов фактора транскрипции, отобранных на этапе c),
e) тестирования конструкции или конструкций синтетического промотора, получаемых на этапе d), на активность в выбранной рекомбинантной клетке-хозяине млекопитающего,
f) идентификации конструкции или конструкций синтетического промотора, которые обладают такой же или улучшенной экспрессией белка по сравнению с промотором дикого типа.
24. Способ по п. 23, включающий дополнительные этапы:
g) отбора двух или более таких регуляторных элементов фактора транскрипции, которые связаны с конструкциями, идентифицированными на этапе f), и
h) получения одной или более конструкций синтетического промотора, содержащей конструкцию TFRE, содержащую или состоящую из таких элементов, независимо отобранных на этапе g).
25. Способ по п. 24, где конструкции TFRE, получаемые на этапе h, содержат регуляторные элементы фактора транскрипции при стехиометрии, которая отражает их относительное содержание в конструкциях, идентифицированных на этапе f).
26. Способ по любому из пп. 23-25, где этап (f) способа дополнительно включает идентификацию регуляторного элемента фактора транскрипции или элементов, которые являются наиболее часто связанными с конструкцией промотора, которая обладает сниженной экспрессией белка по сравнению с промотором дикого типа, и исключения их на этапе (g).
27. Способ идентификации синтетического промотора, подходящего для активации экспрессии рекомбинантного белка в данной рекомбинантной клетке-хозяине млекопитающего на желаемом уровне, включающий этапы:
a) получения двух или более конструкций синтетического промотора, определяемых по п. 21 или 22,
b) тестирования синтетических конструкций промотора, получаемых на этапе a), для определения уровня экспрессии рекомбинантного белка, управляемого каждой конструкцией в выбранной рекомбинантной клетке-хозяине млекопитающего,
c) отбора конструкции синтетического промотора, тестируемой на этапе (b), если она способствует экспрессии рекомбинантного белка на желаемом уровне.
28. Способ по п. 27, где каждый из двух или более синтетических промоторов, получаемых на этапе (a), содержит последовательность, независимо выбранную из любой из SEQ ID NO:30-169 или SEQ ID NO 126-169.
29. Способ по п. 27 или 28, где желаемый уровень экспрессии белка является выше, чем получаемый уровень экспрессии белка с использованием промотора дикого типа.
30. Способ по п. 27 или 28, где желаемый уровень экспрессии белка является ниже, чем получаемый уровень экспрессии белка с использованием промотора дикого типа.
31. Способ конструирования библиотеки конструкций регуляторного элемента фактора транскрипции, включающий этап случайного лигирования регуляторных элементов фактора транскрипции NFκB-RE и E-box в отношении 5:3.
32. Способ конструирования библиотеки конструкций регуляторного элемента фактора транскрипции, включающий этап случайного лигирования регуляторных элементов фактора транскрипции NFκB-RE, E-box, GC-Box и C/EBPα-RE в отношении 5:3:1:1.
33. Клетка CHO, где активность регуляторного элемента фактора транскрипции YY1 обусловлена нокдауном или нокаутом.
34. Клетка CHO по п. 33, где активность YY1 обусловлена нокдауном или нокаутом посредством блок-ловушки, специфической к YY1.
35. Клетка CHO по п. 33 или 34, где клетка дополнительно содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок под контролем синтетического промотора.
Наверх