Набор олигонуклеотидных праймеров, зондов и способ выявления мутации 35delg гена gjb2 методом аллель-специфическая пцр амплификации при наследственной несиндромальной глухоте - заявка 2016136727 на патент на изобретение в РФ

1. ДНК-праймеры и зонды, предназначенные для осуществления способа выявления мутации 35delG гена GJB2 методом аллель-специфическая ПЦР амплификации при наследственной несиндромальной глухоте, в котором используют:
(а) образец геномной ДНК клеточных линий человека Jurkat (производитель «Thermo Scientific», США);
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) в целях обеспечения специфичности амплификации по отношению к выбранному для исследования региону геномной ДНК и обеспечения возможности осуществления анализа генотипа дикого типа в выбранном регионе ДНК, при дизайне праймеров и зондов применены следующие приёмы:
олигонуклеотидные праймеры и зонды обладают специфичностью к противоположным концам последовательностей ДНК выбранных локусов;
олигонуклеотидные праймеры и зонды имеют длину от 15 до 25 нуклеотидов;
амплифицированный фрагмент включая праймеры составляет не более 150 п.о.
температура плавления праймеров и зондов лежит в диапазоне от 55 до 62°С, олигонуклеотидные праймеры и зонды обладают специфичностью к противоположным концам последовательностей ДНК выбранных локусов
праймеры-зонды, имеют длину от 16 до 20 нуклеотидов
(2) синтезируют соответствующие праймеры и праймеры-зонды, удовлетворяющие требованиям пункта (1),
(3) проводят полимеразную цепную реакцию образца (а)
(4) пара праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность реакции ПЦР выше 65 % и линейность при изменении относительной концентрации образца (а) выше 0,9.
2. Набор праймеров и зондов предназначенный для осуществления способа выявления мутации 35delG гена GJB2 методом аллель-специфическая ПЦР амплификации при наследственной несиндромальной глухоте, содержащий одну пару из прямого и обратного праймеров, полученных в соответствии со способом по п.1, и два праймер-зонда соответствующие генотипу дикого типа и мутантному.
3. Набор по п.2, характеризующийся тем, что размер ампликона составляет 81-82 пар нуклеотидов.
4. Набор по п.2, характеризующийся тем, что он включает в себя комбинацию праймеров, состоящие из четырех праймеров разных назначений – прямой праймер, обратный, зонд, соответствующий генотипу дикого типа в позиции 35 гена GJB2 и зонд, соответствующий мутантному генотипу 35delG гена Сx26, представленные в таблице 2;
и/или гомологичные им, по меньшей мере, на 95 % пары праймеров, и/или
5. Набор по п.2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя синтетическую ДНК для положительных контролей.
6. Набор по п.2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя термостабильную ДНК-полимеразу 5 единиц/мкл.
7. Набор по п.2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя водный раствор, содержащий:
приблизительно 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С,
приблизительно 16,6 мМ (NH4)2S04,
приблизительно 6,7 мМ MgCl2,
приблизительно 6,7 мкм ЭДТА,
приблизительно 170 мкг БСА, и
смесь четырех основных dNTP в концентрации приблизительно 0,2 мМ каждого.
8. Набор по п.2, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя воду деионизированную.
9. Способ, использующий набор праймеров и зондов предназначенный для выявления мутации 35delG гена GJB2 методом аллель-специфической ПЦР амплификации при наследственной несиндромальной глухоте, в котором используют:
а) образец крови или букального соскоба пациента;
б) праймеры и зонды по любому из пп. 1-5;
с) набор реактивов для проведения пцр амплификации
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
а) выделяют ДНК из образца крови или букального соскоба (а);
б) проводят реакции полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени выделенного на стадии (1) образца ДНК, реакция полимеразной цепной реакции состоит из начального плавления и ряда циклов из плавления, отжига и синтеза;
с) определяют количество продуктов ПЦР посредством флуоресцентной спектрометрии в присутствии зондов (b).
10. Способ по п.9, характеризующийся тем, что референсным геном является Jurkat.
11. Способ по п.9, характеризующийся тем, что при проведении стадии ПЦР проводят начальное плавление в течение 1-5 мин при температуре 94-96°С, 30-60 раз проводят цикл, включающий плавление при 94-96°С в течение 10÷30 секунд, отжиг и синтез при температуре 28-62°С в течение 40÷60 мин, детекцию продуктов ПЦР проводят во время стадии отжига.
12. Способ по п.9, характеризующийся тем, что в нем концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 400 нМ, зондов – 200 нМ, а температура отжига – 58÷68°С.
13. Выявление мутации 35delG гена GJB2, с использованием набора праймеров и зондов, методом аллель-специфическая ПЦР амплификации при наследственной несиндромальной глухоте проводят по результатам ПЦР в режиме реального времени; при этом наличие/отсутствие Гетерозиготное носительство мутации определяют по испускаемому сигналу флюорисценции, при наличии сигнала по каналу FAM генотип интерпретируется как наличие мутации 35delG гена GJB2 в исследуемом образце, при наличии сигнала по каналу HEX – как норма, а при наличии двух сигналов как – гетерозиготное состояние, носительство мутации 35delG гена GJB2.
Наверх