Способы и композиции для секреции гетерологичных полипептидов - заявка 2016140244 на патент на изобретение в РФ

1. Способ повышения секреции тяжелой цепи антитела и/или легкой цепи антитела из клетки-хозяина E. coli, включающий культивирование клетки-хозяина E. coli, содержащей полинуклеотид, содержащий (1) первый полинуклеотид, кодирующий первый сигнальный пептид, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим тяжелую цепь антитела, причем средняя гидрофобность сигнального пептида составляет более чем около 0,5; и/или (2) второй полинуклеотид, кодирующий второй сигнальный пептид, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим легкую цепь антитела, причем средняя гидрофобность второго сигнального пептида составляет более чем около 0,5, в результате чего после экспрессии антитела в клетке-хозяине тяжелая и легкая цепи уложены и собраны с образованием биологически активного антитела.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гидрофобность первого сигнального пептида составляет более чем около 0,6.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что гидрофобность второго сигнального пептида составляет более чем около 0,6.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первый и/или второй сигнальный пептид представляет собой вариантный котрансляционный сигнальный пептид.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первый и/или второй сигнальный пептид представляет собой вариантный сигнальный пептид DsbA.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что вариантный сигнальный пептид DsbA содержит мутацию в остатке L11, причем вариантный сигнальный пептид DsbA имеет большую среднюю гидрофобность, чем сигнальный пептид DsbA дикого типа с SEQ ID NO:3.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что мутация представляет собой L11I или S18Y.
8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что вариантный сигнальный пептид DsbA содержит последовательность SEQ ID NO:13 или 15.
9. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид Sfmc.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что эффективность TIR (области инициации трансляции) первого и/или второго сигнального пептида составляет около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7 или около 8.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что эффективность TIR первого сигнального пептида составляет около 5, а эффективность TIR второй сигнальной последовательности составляет около 8.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что полинуклеотид в клетке-хозяине дополнительно содержит промотор.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что промотор представляет собой прокариотический промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara и T7.
14. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что клетка-хозяин E. coli представляет собой штамм с дефицитом эндогенной протеазной активности.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что в генотипе E. coli отсутствуют гены degP и prc и присутствует мутантный ген spr.
16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что клетка-хозяин дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один прокариотический полипептид, выбранный из группы, состоящей из DsbA, DsbC, DsbG и FkpA.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что полинуклеотид кодирует как DsbA, так и DsbC.
18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что способ дополнительно включает выделение антитела из культуры клеток-хозяев.
19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что антитело выделяют из культуральной среды клетки-хозяина.
20. Способ по п. 17 или 18, отличающийся тем, что способ дополнительно включает комбинирование выделенного антитела с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или носителем для получения фармацевтического препарата, содержащего антитело.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что по меньшей мере 50% образующихся полипептидных комплексов иммуноглобулина являются антителами.
22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что по меньшей мере 70% образующихся полипептидных комплексов иммуноглобулина являются антителами.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что антитело представляет собой химерное антитело, аффинно созревшее антитело, биспецифическое антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.
25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело.
26. Вариантный сигнальный пептид DsbA, отличающийся тем, что вариант содержит H-область со средней гидрофобностью, составляющей более чем 0,5.
27. Вариантный сигнальный пептид DsbA, содержащий мутацию в остатке S11, причем вариант имеет большую среднюю гидрофобность, чем сигнальный пептид DsbA с SEQ ID NO:3.
28. Вариантный сигнальный пептид DsbA по п. 27, отличающийся тем, что мутация представляет собой L11I и/или S18Y.
29. Вариантный сигнальный пептид STII, содержащий мутацию в остатке S11, причем вариантный сигнальный пептид STII имеет большую среднюю гидрофобность, чем сигнальный пептид STII с SEQ ID NO:1.
30. Вариантный сигнальный пептид STII по п. 29, отличающийся тем, что мутация представляет собой S11A, S11I или S11L.
31. Вариантный сигнальный пептид, состоящий из, состоящий по существу из или содержащий последовательность SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 или 33.
32. Вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30, слитый с гетерологичным белком.
33. Вариантный сигнальный пептид по п. 32, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой тяжелую цепь антитела.
34. Вариантный сигнальный пептид по п. 32, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой легкую цепь антитела.
35. Вариантный сигнальный пептид по п. 32, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой легкую и тяжелую цепь антитела.
36. Вариантный сигнальный пептид по п. 32, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой мультимерный полипептид.
37. Вариантный сигнальный пептид по п. 32, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой иммуноадгезин.
38. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30.
39. Полинуклеотидная последовательность по п. 38, функционально связанная с полинуклеотидом, кодирующим гетерологичный полипептид, причем после экспрессии гетерологичного полипептида в клетке-хозяине гетерологичный полипептид уложен и собран с образованием биологически активного гетерологичного полипептида.
40. Полинуклеотид по п. 39, отличающийся тем, что клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку-хозяина.
41. Полинуклеотид по п. 40, отличающийся тем, что клетка-хозяин представляет собой E. coli.
42. Полинуклеотид, кодирующий антитело, причем указанный полинуклеотид содержит (1) первый полинуклеотид, кодирующий первый сигнальный пептид, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим тяжелую цепь антитела, и (2) полинуклеотид, кодирующий второй сигнальный пептид, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим легкую цепь антитела, причем после экспрессии антитела в клетке-хозяине тяжелая и легкая цепи уложены и собраны с образованием биологически активного антитела, причем первый сигнальный пептид представляет собой вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30 или первый сигнальный пептид состоит, состоит по существу из или содержит последовательность SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 или 42.
43. Полинуклеотид по п. 42, отличающийся тем, что первый сигнальный пептид представляет собой вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30.
44. Полинуклеотид по п. 42, отличающийся тем, что первый сигнальный пептид состоит, состоит по существу из или содержит последовательность SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 или 42.
45. Полинуклеотид по любому из пп. 42-44, отличающийся тем, что второй сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид.
46. Полинуклеотид по любому из пп. 42-44, отличающийся тем, что второй сигнальный пептид представляет собой вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30 или второй сигнальный пептид состоит, состоит по существу из или содержит последовательность SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 или 42.
47. Полинуклеотид по любому из пп. 42-44, отличающийся тем, что второй сигнальный пептид представляет собой вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30.
48. Полинуклеотид по любому из пп. 42-44, отличающийся тем, что второй сигнальный пептид состоит, состоит по существу из или содержит последовательность SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 или 42.
49. Полинуклеотид по любому из пп. 42-48, отличающийся тем, что полинуклеотид, кодирующий антитело, дополнительно содержит (3) полинуклеотид, кодирующий третий сигнальный пептид, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим Fc-полипептид.
50. Полинуклеотид по п. 49, отличающийся тем, что третий сигнальный пептид представляет собой вариантный сигнальный пептид по любому из пп. 26-30 или третий сигнальный пептид состоит, состоит по существу из или содержит последовательность SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 или 42.
51. Полинуклеотид по любому из пп. 39-50, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с гетерологичным полипептидом.
52. Полинуклеотид по п. 51, отличающийся тем, что промотор представляет собой прокариотический промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp и T7.
53. Промотор по п. 52, отличающийся тем, что промотор представляет собой промотор phoA.
54. Полинуклеотид по любому из пп. 39-53, дополнительно содержащий (a) первый промотор, причем первый промотор функционально связан с легкой цепью, и (b) второй промотор, причем второй промотор функционально связан с тяжелой цепью.
55. Полинуклеотид по п. 54, отличающийся тем, что первый и второй промоторы оба являются промоторами phoA.
56. Полинуклеотид по п. 54, дополнительно содержащий (c) третий промотор, причем третий промотор функционально связан с Fc-полипептидом.
57. Полинуклеотид по п. 56, отличающийся тем, что промотор представляет собой промотор phoA.
58. Полинуклеотид по любому из пп. 39-41, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой протеазу, иммуноадгезин, внеклеточный домен рецептора, гетеромультимерный белок или антитело.
59. Полинуклеотид по любому из пп. 42-57, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
60. Полинуклеотид по п. 59, отличающийся тем, что антитело представляет собой химерное антитело, биспецифическое антитело, гуманизированное антитело, фрагмент антитела или человеческое антитело.
61. Полинуклеотид по п. 59, отличающийся тем, что фрагмент антитела представляет собой антитело с одним плечом.
62. Полинуклеотид по п. 59, отличающийся тем, что антитело представляет собой биспецифическое антитело.
63. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 39-62.
64. Вектор по п. 63, отличающийся тем, что вектор представляет собой экспрессионный вектор.
65. Композиция, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 39-64.
66. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 64.
67. Клетка-хозяин по п. 66, отличающаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку.
68. Клетка-хозяин по п. 67, отличающаяся тем, что прокариотическая клетка представляет собой E. coli.
69. Клетка-хозяин по п. 68, отличающаяся тем, что E. coli представляет собой штамм с дефицитом эндогенной протеазной активности.
70. Клетка-хозяин по п. 68 или 69, отличающаяся тем, что в генотипе E. coli отсутствуют гены degP и prc и присутствует мутантный ген spr.
71. Клетка-хозяин по любому из пп. 66-70, отличающаяся тем, что клетка-хозяин дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий прокариотический белок шаперона.
72. Клетка-хозяин по п. 71, отличающаяся тем, что прокариотический белок шаперона представляет собой DsbA и/или DsbC.
73. Клетка-хозяин по п. 71 или 72, отличающаяся тем, что клетка-хозяин сверхэкспрессирует прокариотический белок шаперона.
74. Способ получения гетерологичного полипептида (такого как тяжелая цепь и/или легкая цепь антитела), причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 66-73 таким образом, чтобы происходила экспрессия нуклеиновой кислоты, причем после экспрессии указанного полинуклеотида в клетке-хозяине гетерологичный полипептид уложен с образованием биологически активного гетерологичного полипептида.
75. Способ по п. 74, отличающийся тем, что способ дополнительно включает выделение гетерологичного полипептида из культуры клеток-хозяев.
76. Способ по п. 75, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид выделяют из культуральной среды клеток-хозяев.
77. Способ по п. 74 или 75, отличающийся тем, что способ дополнительно включает комбинирование выделенного гетерологичного полипептида с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или носителем с получением фармацевтического препарата, содержащего гетерологичный полипептид.
78. Способ секреции гетерологичного полипептида (такого как тяжелая цепь и/или легкая цепь антитела) из клетки, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 66-73 таким образом, чтобы происходила экспрессия нуклеиновой кислоты и секреция гетерологичного полипептида.
79. Способ транслокации гетерологичного полипептида (такого как тяжелая цепь и/или легкая цепь антитела) из клетки, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 66-73 так, чтобы происходила экспрессия нуклеиновой кислоты и транслокация гетерологичного полипептида.
80. Гетерологичный полипептид, полученный способом по любому из пп. 74-79.
81. Полипептид по п. 81, отличающийся тем, что полипептид представляет собой антитело.
Наверх