Антигенсвязывающие белки vl, проявляющие различные связывающие характеристики - заявка 2016141123 на патент на изобретение в РФ

1. Антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельные домены первой и второй легкой цепи иммуноглобулина, причем вариабельные домены первой и второй легкой цепи иммуноглобулина ассоциированны для формирования связывающего кармана, который специфически связывает малую молекулу.
2. Антигенсвязывающий белок по п. 1, отличающийся тем, что вариабельный домен первой и/или второй легкой цепи иммуноглобулина представляет собой вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека.
3. Антигенсвязывающий белок по п. 1, отличающийся тем, что связывающий карман вариабельных доменов легкой цепи связывает малую молекулу с аффинностью 50 нМ или менее.
4. Антигенсвязывающий белок по п. 1, отличающийся тем, что вариабельный домен первой и/или второй легкой цепи иммуноглобулина функционально связан с константной областью первой тяжелой цепи иммуноглобулина.
5. Антигенсвязывающий белок по п. 4, отличающийся тем, что константная область первой тяжелой цепи иммуноглобулина происходит от животного, не являющегося человеком.
6. Антигенсвязывающий белок по п. 5, отличающийся тем, что животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна, выбранного из мыши и крысы.
7. Антигенсвязывающий белок по п. 1, отличающийся тем, что вариабельный домен первой легкой цепи иммуноглобулина кодируется первым реаранжированным геном вариабельной области легкой цепи, полученным из а) генного сегмента Vκ4-1, генного сегмента Vκ1-5, генного сегмента Vκ3-15, генного сегмента Vκ3-20 или генного сегмента Vκ1-33, и б) генного сегмента Jκ1, генного сегмента Jκ3, генного сегмента Jκ4 или генного сегмента Jκ5.
8. Антигенсвязывающий белок по п. 7, отличающийся тем, что первый реаранжированный ген вариабельной области легкой цепи получен из генного сегмента Vκ4-1 и генного сегмента Jκ1.
9. Антигенсвязывающий белок по п. 7, отличающийся тем, что первый реаранжированный ген вариабельной области легкой цепи получен из генного сегмента 1-5 Vκ и генного сегмента Jκ, выбранного из группы, состоящей из генного сегмента Jκ3, генного сегмента Jκ4 и генного сегмента Jκ5.
10. Антигенсвязывающий белок по п. 7, отличающийся тем, что вариабельный домен второй легкой цепи иммуноглобулина кодируется реаранжированным геном вариабельной области легкой цепи, полученным из генного сегмента 3-20 Vκ человека.
11. Способ получения антигенсвязывающего белка VL, который специфически связывает малую молекулу, включающий этап(-ы):
a) иммунизации генетически модифицированного животного, не являющегося человеком, малой молекулой, причем генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, содержит
(i) нереаранжированные вариабельные генные сегменты легкой цепи (VL) и соединительные генные сегменты легкой цепи (JL) иммуноглобулина человека, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи нечеловеческого происхождения, и
(ii) нереаранжированные вариабельные генные сегменты легкой цепи (VL) и соединительные генные сегменты легкой цепи (JL) иммуноглобулина человека, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи нечеловеческого происхождения; и
b) выделения клетки или антигенсвязывающего белка VL из иммунизированного животного, не являющегося человеком, причем клетка или антигенсвязывающий белок VL специфически связывает малую молекулу.
12. Способ по п. 11, дополнительно включающий:
c) культивирование клетки, трансфицированной вектором, в условиях, достаточных для экспрессии вектора, причем вектор содержит нуклеиновую кислоту, функционально связанную с геном константной области тяжелой цепи человека, причем нуклеиновая кислота является идентичной или, по существу, идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен антигенсвязывающего белка VL, выделенного на этапе b).
13. Способ по п. 11, дополнительно включающий этапы:
c) отбора антигенсвязывающего белка VL из супернатанта культуры гибридомы, причем гибридому получают из клетки, выделенной на этапе b).
14. Способ по п. 13, дополнительно включающий:
d) культивирование клетки, трансфицированной вектором, в условиях, достаточных для экспрессии вектора, причем вектор содержит нуклеиновую кислоту, функционально связанную с геном константной области тяжелой цепи человека, причем нуклеиновая кислота является идентичной или, по существу, идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен VL антигенсвязывающего белка, отобранного на этапе с).
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что малая молекула представляет собой гаптен, связанный с носителем, или органическое соединение, молекулярная масса которого составляет менее чем 6 кДа.
16. Способ по п. 11, отличающийся тем, что животное, не являющееся человеком, представляет собой млекопитающее.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна, выбранного из мыши и крысы.
18. Гибридома, полученная из клетки, выделенной согласно способу по п. 11.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен антигенсвязывающего белка VL, выделенного согласно способу по п. 11.
20. Клетка, выделенная согласно способу по п. 11.
21. Генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, содержащее:
a) в своем геноме
(i) нереаранжированные вариабельные генные сегменты легкой цепи (VL) и соединительные генные сегменты легкой цепи (JL) иммуноглобулина человека, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи нечеловеческого происхождения, и
(ii) нереаранжированные вариабельные генные сегменты легкой цепи (VL) и соединительные генные сегменты легкой цепи (JL) иммуноглобулина человека, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи нечеловеческого происхождения; и
b) VL антигенсвязывающий белок, который специфически связывает малую молекулу.
22. Генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, по п. 21, отличающееся тем, что животное, не являющееся человеком, проявляет 2-х кратное или более повышение титра белка, специфически связывающего малую молекулу, по сравнению с контрольным животным, не являющимся человеком.
23. Способ идентификации одного или более антигенсвязывающих белков VL, которые проявляют уникальную характеристику связывания с антигеном по сравнению с обычными антителами, включающий:
а) профилирование одной или более связывающих характеристик каждого из множества иммуноглобулиновых белков, которые связываются с антигеном, причем множество иммуноглобулиновых белков включает антигенсвязантигенсвязывающие белки VL и обычные антитела,
причем каждый VL антигенсвязывающий белок содержит гибридную иммуноглобулиновую цепь, содержащую (i) вариабельный домен, полученный из одного или более генных сегментов вариабельной области легкой цепи, и (ii) константный домен, полученный из одного или более генных сегментов константной области тяжелой цепи, и
при этом каждое обычное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, полученную из вариабельной области одной или более тяжелых цепей, и
сегмент гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, полученный из одного или более генных сегментов вариабельной области легкой цепи;
b) сортировку множества иммуноглобулиновых белков в одну или более групп на основании по меньшей мере одной связывающей характеристики каждого из иммуноглобулиновых белков, причем антигенсвязантигенсвязывающие белки VL и обычные антитела, проявляющие схожую характеристику связывания, сортируются в одну группу; и
c) определение группы, которая включает все или, по существу, все VL антигенсвязывающие белки.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что одна или более связывающих характеристик каждого из множества иммуноглобулиновых белков профилированы путем дифференциального нарушения антигена.
25. Способ по п. 23, дополнительно включающий картирование одного или более эпитопов антигена, связанного с каждым из множества иммуноглобулиновых белков; причем иммуноглобулиновые белки, связывающие один и тот же эпитоп антигена, сортируются в одну функциональную группу.
26. Способ по п. 23, отличающийся тем, что сортировка каждого из иммуноглобулиновых белков включает метод главных компонент (МГК).
27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что сортировка каждого из иммуноглобулиновых белков включает иерархическую кластеризацию.
28. Способ по п. 23, отличающийся тем, что группы формируют на основании профиля связывания, содержащего константу ассоциации, константу диссоциации, специфичность к эпитопу, аффинность к эпитопу или их комбинацию.
29. Способ по п. 23, дополнительно включающий в качестве заключительного этапа:
d) выделение одного или более VL антигенсвязывающих белков, отсортированных в функциональную группу, идентифицированную как содержащую все или, по существу, все антигенсвязантигенсвязывающие белки VL.
30. Способ по п. 29, дополнительно включающий в качестве заключительного этапа:
e) подтверждение того, что один или более выделенных VL антигенсвязывающих белков связывают один или более эпитопов антигена, которые не распознаются обычными антителами.
31. Способ по п. 30, дополнительно включающий секвенирование гибридной иммуноглобулиновой цепи из одного или более выделенных VL антигенсвязывающих белков.
Наверх