Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения - заявка 2016142690 на патент на изобретение в РФ

1. Полипептид, содержащий молекулу на основе каркаса, содержащую петлевые домены, топологически подобные доменам фибронектина типа III, где полипептид имеет аминокислотную последовательность на основе консенсусной последовательности доменов фибронектина типа III, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, в которой специфические остатки последовательности SEQ ID NO: 16 заменены, что повышает химическую стабильность и термостабильность указанной молекулы на основе каркаса.
2. Полипептид по п. 1, в котором термостабильность измеряют как температуру плавления (Tm) с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии, и химическую стабильность измеряют как [D] по стабильности к индуцируемой хлоридом гуанидина денатурации.
3. Полипептид по п. 2, в котором Tm повышена по сравнению с молекулой на основе каркаса, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 с энергетической ценностью от приблизительно 4,18 кДж (1 ккал) до приблизительно 50,21 кДж (12 ккал).
4. Полипептид по п. 2, в котором [D]50%, по сравнению с молекулой на основе каркаса, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, повышается с приблизительно 0,1 до приблизительно 2,0 М, и свободная энергия (ΔG), по сравнению с молекулой на основе каркаса, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, повышается с 0,418 до приблизительно 41,8 кДж/моль (с 0,1 до приблизительно 10 ккал/моль).
5. Полипептид, содержащий молекулу на основе каркаса, содержащую петлевые домены, топологически подобные доменам фибронектина типа III, где полипептид имеет аминокислотную последовательность на основе консенсусной последовательности доменов фибронектина типа III, имеющей аминокислотную последовательность одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 142-151.
6. Полипептид, содержащий молекулу на основе каркаса, содержащую петлевые домены, топологически подобные доменам фибронектина типа III, полипептид имеет аминокислотную последовательность на основе консенсусной последовательности доменов фибронектина типа III, где имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, причем специфические остатки последовательности SEQ ID NO: 16 заменены, что повышает химическую стабильность и термостабильность указанной молекулы на основе каркаса, где молекула на основе каркаса содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из N46V, E11N, E14P, L17A E86I, G73Y, E37P и E86I.
7. Полипептид по любому из пп. 1-5 с петлями, способными к взаимодействию с мишенью, причем петлевые участки модифицировали для включения альтернативных остатков в положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81 аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 16 и 142-151.
8. Полипептид по п. 6, где указанный полипептид связывает мишень с по меньшей мере одной аффинностью, выбранной из: KD с по меньшей мере 10-9 M, по меньшей мере 10-10 M, по меньшей мере 10-11 M, по меньшей мере 10-12 M, по меньшей мере 10-13 M, по меньшей мере 10-14 M и по меньшей мере 10-15 M, как определили методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Kinexa.
9. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по п. 5.
10. Вектор выделенной нуклеиновой кислоты, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 9.
11. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 9.
12. Клетка-хозяин по п. 11, представляющая собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из E. coli BL21Star(DE3), иной клетки E. coli, дрожжей, клетки насекомого, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, миеломных или лимфомных клеток, либо любых их производных, иммортализованных или трансформированных клеток.
13. Композиция, содержащая полипептид по п. 5 и по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
14. Композиция по п. 13, дополнительно содержащая, по меньшей мере, одно соединение или полипептид, выбранные из детектируемой метки или репортера, антагониста TNF, противоинфекционного лекарственного средства, лекарственного средства для сердечнососудистой системы, лекарственного средства для центральной нервной системы (ЦНС), лекарственного средства для вегетативной нервной системы (ВНС), лекарственного средства для респираторного тракта, лекарственного средства для желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства для водно-солевого баланса, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого лекарственного средства, иммуномодулирующего лекарственного средства, лекарственного средства для органов зрения, слуха или обоняния, лекарственного средства топического действия, питательного лекарственного средства, цитокина и антагониста цитокина.
15. Медицинское устройство, содержащее полипептид по п. 5, где указанное устройство пригодно для взаимодействия с указанным полипептидом или его введения с использованием, по меньшей мере, одного способа введения, выбранного из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсульного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, внутримозжечкового, внутрицеребровентрикулярного, внутрикишечного, внутрицервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипредстательного, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, внутрисетчаточного, внутрипозвоночного, внутрисуставного, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, внутриочагового, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального способов введения.
16. Изделие промышленного производства для использования в фармацевтических или диагностических целях у человека, содержащее упаковочный материал и контейнер, содержащий полипептид по п. 5 в форме раствора или в лиофилизированной форме.
17. Изделие промышленного производства по п. 16, в котором указанный контейнер представляет собой компонент устройства или системы доставки, осуществляемой одним из следующих способов: парентеральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрисуставным, внутрибронхиальным, внутрибрюшным, внутрикапсульным, внутрихрящевым, внутриполостным, внутриклеточным, внутримозжечковым, внутрицеребровентрикулярным, внутрикишечным, внутрицервикальным, внутрижелудочным, внутрипеченочным, внутримиокардиальным, внутрикостным, внутритазовым, внутриперикардиальным, внутрибрюшинным, внутриплевральным, внутрипредстательным, внутрилегочным, внутриректальным, внутрипочечным, внутрисетчаточным, внутрипозвоночным, внутрисуставным, внутригрудным, внутриматочным, внутрипузырным, внутриочаговым, болюсным, вагинальным, ректальным, буккальным, сублингвальным, интраназальным или трансдермальным введением.
18. Выделенный белковый каркас на основе домена фибронектина типа III (FN3), содержащий аминокислотную последовательность, полученную из консенсусной последовательности доменов FN3 тенасцина, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 142-151, дополнительно содержащий замены в петлях B:C (остатки 22-28) или F:G (остатки 75-81), причем белковый каркас выбран путем связывания с белком-мишенью.
19. Выделенный белковый каркас по п. 18, в котором белок-мишень представляет собой IgG человека, TNF альфа человека или их фрагмент.
20. Выделенный белковый каркас по п. 19, в котором петли B:C (остатки 22-28) или F:G (остатки 75-81) представлены одной или более последовательностями SEQ ID NO: 21-140, а белковый каркас связывается с IgG человека.
21. Белковый каркас по п. 20, в котором каркас содержит 7 нитей и 6 петель между нитями.
22. Белковый каркас по п. 20, содержащий аминокислотную последовательность любой из петель B:C или F:G в последовательностях SEQ ID NO: 21-140, причем белковый каркас формирует петли у или возле остатков 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81.
23. Выделенный белковый каркас на основе домена фибронектина типа III (FN3), Tencon 16 (SEQ ID NO: 16), имеющий замену, выбранную из группы, состоящей из N46V, E11N, E14P, E86I, N46V и E86I, всех замен E14P, N46V и E86I, а также всех из замен L17A, N46V и E86I, дополнительно содержащий:
остовную часть с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 16 у остатков 1-21, 29-74 и 82-89;
часть петли B:C между остатками 21 и 29 в последовательности SEQ ID NO: 16, по меньшей мере, на 75% идентичную любому из остатков последовательности SEQ ID NO: 21-45; и
часть петли F:G между остатками 74 и 82 последовательности SEQ ID NO: 16, по меньшей мере на 75% идентичную любому из остатков последовательности SEQ ID NO: 46-140, причем белковый каркас способен связываться с IgG человека.
24. Белковый каркас по п. 23, в котором указанный каркас связывает мишень с, по меньшей мере, одной аффинностью, выбранной из KD, меньше или равной 10-9 M, меньше или равной 10-10 M, меньше или равной 10-11 M, меньше или равной 10-12 M, меньше или равной 10-13 M, меньше или равной 10-14 M и меньше или равной 10-15 M, как определили методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Kinexa.
25. Белковый каркас по п. 24, в котором петли образуют сайты для связывания с IgG.
26. Выделенный белковый каркас на основе домена фибронектина типа III (FN3), содержащий аминокислотную последовательность, полученную из консенсусной последовательности домена FN3 тенасцина, причем указанный белковый каркас способен связываться с IgG человека.
Наверх