Способ получения l-аминокислот с помощью коринебактерий с применением системы расщепления глицина - заявка 2016143585 на патент на изобретение в РФ

1. Система расщепления глицина, содержащая ферменты GcvP, GcvT и GcvH, отличающаяся тем, что указанная система содержит по меньшей мере один из следующих полипептидов:
a) фермент GcvP с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 40,
b) фермент GcvТ с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 42,
c) фермент GcvН с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 38.
2. Система расщепления глицина по п.1, отличающаяся тем, что указанная система содержит два, предпочтительно все три из упомянутых выше полипептидов.
3. Система расщепления глицина по п.2, отличающаяся тем, что указанная система содержит следующие полипептиды:
a) фермент GcvP с последовательностью, которая по меньшей мере на 95 или 98% идентична последовательности под SEQ ID NO: 40,
b) фермент GcvТ с последовательностью, которая по меньшей мере на 95 или 98% идентична последовательности под SEQ ID NO: 42,
c) фермент GcvН с последовательностью, которая по меньшей мере на 95 или 98% идентична последовательности под SEQ ID NO: 38.
4. Система расщепления глицина по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанная система содержит по меньшей мере один дополнительный полипептид, выбранный из группы, включающей:
a) фермент LipA с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 48,
b) фермент LipB с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 50,
c) фермент Lpd с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 52,
d) фермент LplA с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 94,
e) фермент GcvL с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности под SEQ ID NO: 96.
5. Полипептиды, которые представляют собой ферменты системы расщепления глицина, выбранные из группы, включающей:
a) фермент GcvP с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 40,
b) фермент GcvT с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 42,
c) фермент GcvН с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 38,
d) фермент LipA, предпочтительно фермент LipA с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 48,
e) фермент LipВ, предпочтительно фермент LipВ с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 50,
f) фермент Lpd, предпочтительно фермент Lpd с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 52,
g) фермент LplA, предпочтительно фермент LplA с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 94,
h) фермент GcvL, предпочтительно фермент GcvL с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85 или 90%, в частности по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 96.
6. Полинуклеотиды, которые кодируют ферменты системы расщепления глицина, выбранные из группы, включающей:
a) полинуклеотид (gcvP), который кодирует фермент GcvP и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-3162 под SEQ ID NO: 39, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-3162 под SEQ ID NO: 39;
b) полинуклеотид (gcvT), который кодирует фермент GcvT и имеет последовательность, которая
по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-1404 под SEQ ID NO: 41, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1404 под SEQ ID NO: 41;
c) полинуклеотид (gcvH), который кодирует фермент GcvН и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-699 под SEQ ID NO: 37, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-699 под SEQ ID NO: 37;
d) полинуклеотид (lipA), который кодирует фермент LipA и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-1344 под SEQ ID NO: 47, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1344 под SEQ ID NO: 47;
e) полинуклеотид (lipB), который кодирует фермент LipB и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-1089 под SEQ ID NO: 49, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1089 под SEQ ID NO: 49;
f) полинуклеотид (lpd), который кодирует фермент Lpd и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-1710 под SEQ ID NO: 51, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1710 под SEQ ID NO: 51;
g) полинуклеотид (IpIA), который кодирует фермент LplA и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-1089 под SEQ ID NO: 93, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1089 под SEQ ID NO: 93;
h) полинуклеотид (gcvL), который кодирует фермент GcvL и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, в частности по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности по меньшей мере на 98 или 100% идентична последовательности в положениях 301-1710 под SEQ ID NO: 95, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1710 под SEQ ID NO: 95.
7. Вектор, отличающийся тем, что указанный вектор содержит по меньшей мере один полинуклеотид, предпочтительно по меньшей мере два или три полинуклеотида по п.6.
8. Рекомбинантный микроорганизм, отличающийся тем, что указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну систему расщепления глицина по любому из пп.1-4, и/или полинуклеотиды, кодирующие такую систему расщепления глицина, и/или по меньшей мере один полипептид по п.5, и/или полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, или полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, и/или по меньшей мере один полинуклеотид по п.6, и/или вектор по п.7.
9. Рекомбинантный микроорганизм по п.8, отличающийся тем, что система расщепления глицина и/или полинуклеотиды, кодирующие такую систему, присутствуют в сверхэкспрессируемой форме.
10 Рекомбинантный микроорганизм по п. 8 или 9, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой штамм, который продуцирует в избыточном количестве L-метионин, имеющий по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два или три, в частности предпочтительно по меньшей мере четыре или пять из следующих компонентов:
a) аттенуированный полинуклеотид (mcbR), который кодирует ДНК-связывающий домен HTH tetR-типа (McbR), предпочтительно ДНК-связывающий домен с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 2,
b) аттенуированный полинуклеотид (ген thrB), который кодирует гомосеринкиназу (ThrB, EC 2.7.1.39), предпочтительно гомосеринкиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 4,
c) аттенуированный полинуклеотид (pgi), который кодирует глюкозо-6-фосфат-изомеразу (Pgi, EC 5.3.1.9), предпочтительно глюкозо-6-фосфат-изомеразу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6,
d) аттенуированный полинуклеотид (pck), который кодирует фосфоенолпируваткарбоксикиназу (Pck, EC 4.1.1.32), предпочтительно фосфоенолпируваткарбоксикиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 8,
e) аттенуированный полинуклеотид (metQ), который кодирует D-метионин-связывающий липопротеин (MetQ), предпочтительно D-метионин-связывающий липопротеин с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 10,
f) аттенуированный полинуклеотид (metP), который кодирует транспортер метионина (MetР), предпочтительно транспортер метионина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 12,
g) аттенуированный полинуклеотид (metN), который кодирует АТФ-зависимый транспортер метионина (MetN), предпочтительно АТФ-зависимый транспортер метионина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 14,
h) аттенуированный полинуклеотид (metK), который кодирует S-аденозилметионинсинтазу (MetК), предпочтительно S-аденозилметионинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16,
i) аттенуированный полинуклеотид (metI), который кодирует пермеазу системы импорта метионина (MetI), предпочтительно пермеазу системы импорта метионина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 18,
j) аттенуированный полинуклеотид (dapA), который кодирует 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазу (DapA), предпочтительно 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 20,
k) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (CBS), который кодирует цистеинсинтазу (CBS), предпочтительно цистеинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 22,
l) аттенуированный полинуклеотид, который кодирует гомолог cg3031, предпочтительно гомолог cg3031 с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 24,
m) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (aecD), который кодирует цистатионин-бета-лиазу (AecD), предпочтительно цистатионин-бета-лиазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 26,
n) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (asd), который кодирует аспартатполуальдегиддегидрогеназу (Asd), предпочтительно аспартатполуальдегиддегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 28,
o) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metH), который кодирует 5-метилтетрагидрофолатгомоцистеинметилтрансферазу (MetH, EC 2.1.1.13),
p) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (brnE), который кодирует малую субъединицу транспортера аминокислот с разветвленной цепью (BrnE), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 30,
q) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (brnF), который кодирует большую субъединицу транспортера аминокислот с разветвленной цепью (BrnF), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 32,
r) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysE), который кодирует серинацетилтрансферазу (CysE), предпочтительно серинацетилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 34,
s) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysK), который кодирует цистеинсинтазу (CysK), предпочтительно цистеинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 36,
t) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (glyA), который кодирует серингидроксиметилтрансферазу (GlyA), предпочтительно серингидроксиметилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 44,
u) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (hom), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом гомосериндегидрогеназу (Hom), предпочтительно гомосериндегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 46,
v) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lysC), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназу (LysC), предпочтительно аспартаткиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 54,
w) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metB), который кодирует цистатионин-гамма-синтазу (MetB), предпочтительно цистатионин-гамма-синтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 56,
x) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metF), который кодирует 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазу (MetF), предпочтительно 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 58,
y) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metX), который кодирует гомосерин-О-ацетилтрансферазу (MetX), предпочтительно гомосерин-О-ацетилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 60,
z) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metY), который кодирует O-ацетилгомосеринлиазу (MetY), предпочтительно O-ацетилгомосеринлиазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 62,
{) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (pyc), который кодирует пируваткарбоксилазу (Рyc), предпочтительно пируваткарбоксилазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 64,
|) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (serA), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом D-3-фосфоглицератдегидрогеназу (SerA), предпочтительно D-3-фосфоглицератдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 66,
}) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (serB), который кодирует фосфосеринфосфатазу (serB), предпочтительно фосфосеринфосфатазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 68,
~) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (serC), который кодирует фосфосеринаминотрансферазу (SerC), предпочтительно фосфосеринаминотрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 70,
) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ald), который кодирует аланиндегидрогеназу (Ald), предпочтительно аланиндегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 72,
€) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysD), который кодирует субъединицу сульфатаденилилтрансферазы (CysD), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 74,
) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysH), который кодирует аденозинфосфосульфатредуктазу (CysH), предпочтительно аденозинфосфосульфатредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 76,
‚) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysI), который кодирует сульфитредуктазу (CysI), предпочтительно сульфитредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 78,
ƒ) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysJ), который кодирует (CysJ), предпочтительно (CysJ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 80,
„) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysN), который кодирует субъединицу сульфатаденилилтрансферазы (CysN), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 82,
…) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysY), который кодирует цистатионин-бета-синтазу (CysY), предпочтительно цистатионин-бета-синтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 84,
†) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysZ), который кодирует предполагаемый транспортер сульфата (CysZ), предпочтительно транспортер сульфата с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 86,
‡) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metE), который кодирует 5-метилтетрагидроптероилтриглутаматгомоцистеинметилтрaнсферазу (MetE), предпочтительно белок с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 88,
ˆ) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ptH1), который кодирует пептидил-tRNA-гидролазу 1 (PtH1), предпочтительно пептидил-tRNA-гидролазу 1 с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 90,
‰) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ptH2), который кодирует пептидил-tRNA-гидролазу 2 (PtH2), предпочтительно пептидил-tRNA-гидролазу 2 с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 92.
11. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой коринеформную бактерию, в частности коринебактерию, предпочтительно C.glutamicum или C.humireducens.
12. Способ получения в избыточном количестве L-аминокислоты, отличающийся тем, что в указанном способе применяют систему расщепления глицина по любому из пп.1-4, и/или по меньшей мере один полипептид по п.5, и/или по меньшей мере один полинуклеотид по п.6, и/или вектор по п.7, и/или рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.8-11.
13. Способ по предыдущему пункту, отличающийся тем, что продуцируемая в избыточном количестве L-аминокислота выбрана из L-аланина, L-валина, L-аминокислот семейства глутамата, в частности L-глутамата, L-глутамина, L-пролина и L-аргинина, и L-аминокислот семейства аспартата, в частности L-аспартата, L-аспарагина, L-метионина, L-лизина, L-изолейцина и L-треонина.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что продуцируемая в избыточном количестве L-аминокислота представляет собой L-метионин.
15. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что в качестве побочного продукта образуются лишь незначительные количества глицина.
Наверх