Получение генно-инженерных т-клеток посредством транспозона "спящая красавица" в сочетании с отбором метотрексатом - заявка 2016143389 на патент на изобретение в РФ

1. Полинуклеотид для доставки генов для стабильного встраивания нуклеиновой кислоты в олигонуклеотид, при этом указанная нуклеиновая кислота для встраивания фланкирована генными последовательностями инвертированного концевого повтора в полинуклеотиде для доставки генов, и при этом полинуклеотид для доставки генов является селектируемым, при этом указанный полинуклеотид для доставки генов содержит:
первую последовательность, при этом указанная первая последовательность содержит первую генную последовательность инвертированного концевого повтора;
вторую последовательность, при этом указанная вторая последовательность содержит вторую генную последовательность инвертированного концевого повтора;
третью последовательность, при этом указанная третья последовательность содержит последовательность промоторной области;
четвертую последовательность, при этом указанная четвертая последовательность содержит по меньшей мере один ген, при этом указанный по меньшей мере один ген кодирует белок или кодирует последовательность для транскрипции мРНК, и при этом указанная четвертая последовательность оптимизирована;
пятую последовательность, при этом указанная пятая последовательность содержит по меньшей мере одну селектируемую маркерную кассету, кодирующую двойной мутант дигидрофолатредуктазы, при этом указанный двойной мутант дигидрофолатредуктазы обладает в 15000 раз или примерно в 15000 раз сниженной аффинностью к метотрексату, при этом указанный метотрексат можно применять для отбора клеток, трансдуцированных полинуклеотидом для доставки генов, для увеличения соотношения клеток, экспрессирующих по меньшей мере один ген, и при этом указанная пятая последовательность оптимизирована;
шестую последовательность, при этом указанная шестая последовательность содержит первый сайт присоединения (attP); и
седьмую последовательность, при этом указанная седьмая последовательность содержит второй сайт присоединения (attB); при этом каждая из: первой последовательности, второй последовательности, третьей последовательности, четвертой последовательности, пятой последовательности, шестой последовательности и седьмой последовательности имеет 5'-конец и 3'-конец, и при этом 3'-конец первой последовательности, содержащей первую генную последовательность инвертированного концевого повтора, примыкает к 5'-концу третьей последовательности, 3'-конец третьей последовательности примыкает к 5'-концу четвертой последовательности, 3'-конец четвертой последовательности примыкает к 5'-концу пятой последовательности, и 3'-конец пятой последовательности примыкает к 5'-концу второй последовательности, содержащей второй инвертированный концевой повтор.
2. Полинуклеотид для доставки генов по п. 1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид для доставки генов является кольцевым.
3. Полинуклеотид для доставки генов по п. 1 или 2, отличающийся тем, что длина указанного полинуклеотида для доставки генов составляет по меньшей мере от 1 т.п.н. до 5 т.п.н.
4. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что промоторная область содержит промоторную последовательность EF1.
5. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что четвертая последовательность содержит один, два, три, четыре или пять генов, которые кодируют белки.
6. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что четвертая последовательность кодон-оптимизирована для уменьшения общего соотношения GC/AT четвертой последовательности.
7. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что четвертая последовательность оптимизирована путем оптимизации кодонов для экспрессии у людей.
8. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что четвертая последовательность представляет собой консенсусную последовательность, полученную из множества нуклеиновых кислот, которые кодируют множество родственных белков.
9. Полинуклеотид для доставки генов по пп. 1-2, отличающийся тем, что четвертая последовательность представляет собой консенсусную последовательность, полученную из множества нуклеиновых кислот, которые кодируют множество родственных белков, таких как множество связывающих доменов антител, которые специфичны в отношении одного и того же эпитопа.
10. Полинуклеотид для доставки генов по п. 8, отличающийся тем, что множество родственных белков содержат множество связывающих доменов антител, при этом указанное множество связывающих доменов антител специфичны в отношении одного и того же эпитопа.
11. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2 и 10, отличающийся тем, что пятая последовательность кодон-оптимизирована для уменьшения общего соотношения GC/AT пятой последовательности.
12. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2 и 10, отличающийся тем, что пятая последовательность оптимизирована путем оптимизации кодонов для экспрессии у людей.
13. Полинуклеотид для доставки генов по п. 6, отличающийся тем, что оптимизацию кодонов и/или консенсусную последовательность получают путем сравнения вариабельности последовательности и/или нуклеотидных оснований, используемых во множестве родственных последовательностей.
14. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, 10 и 13, отличающийся тем, что белок представляет собой белок для терапии.
15. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, 10 и 13, отличающийся тем, что белок содержит антитело или его часть, которая может быть гуманизированной.
16. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, 10 и 13, отличающийся тем, что двойной мутант дигидрофолатредуктазы содержит мутации аминокислот L22F и F31S.
17. Полинуклеотид для доставки генов по любому из пп. 1-2, 10 и 13, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид для доставки генов представляет собой миникольцо.
18. Способ получения генно-инженерных мультиплексированных Т-клеток для адоптивной иммунотерапии Т-клетками, включающий:
получение полинуклеотида для доставки генов по любому из пп. 1-17;
введение указанного полинуклеотида для доставки генов в Т-клетку;
получение вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица» (Sleeping Beauty);
введение указанного вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица», в Т-клетку;
отбор клеток, содержащих полинуклеотид для доставки генов; при этом отбор включает первый круг отбора и второй круг отбора, при этом указанный первый круг отбора включает добавление реагента для отбора в первом диапазоне концентраций, и указанный второй круг отбора включает добавление реагента для отбора во втором диапазоне концентраций, при этом второй диапазон концентраций выше первого диапазона концентраций, и при этом второй диапазон концентраций по меньшей мере в 1,5 раза выше первого диапазона концентраций; и
выделение Т-клеток, экспрессирующих фенотип, под селективным давлением.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что введение осуществляют путем электропорации.
20. Способ по п. 18 или 19, отличающийся тем, что отбор осуществляют путем повышения селективного давления посредством селективной маркерной кассеты.
21. Способ по любому из пп. 18-19, отличающийся тем, что реагент для отбора включает агент для отбора.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что агент для отбора представляет собой метотрексат.
23. Способ по любому из пп. 18-19 и 22, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 50 нМ - 100 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 75 до 150 нМ.
24. Способ по любому из пп. 18-19 и 22, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 75 нМ - 150 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 112,5 до 225 нМ.
25. Способ по любому из пп. 18-19 и 22, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 300 нМ - 675 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 450 до 1012 нМ.
26. Способ по любому из пп. 18-19 и 22, отличающийся тем, что первый круг отбора включает подвергание Т-клеток воздействию агента для отбора в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней перед вторым кругом отбора.
27. Способ по любому из пп. 18-19 и 22, отличающийся тем, что второй круг отбора включает подвергание Т-клеток воздействию агента для отбора в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, или любого времени в диапазоне моментов времени, определяемом любыми двумя из вышеуказанных моментов времени, перед выделением.
28. Способ увеличения выработки белка в Т-клетке, включающий:
получение полинуклеотида по любому из пп. 1-17;
введение указанного полинуклеотида в клетку;
получение вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица»;
введение указанного вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица», в Т-клетку;
отбор клеток, содержащих полинуклеотид для доставки генов; при этом отбор включает первый круг отбора и второй круг отбора, при этом указанный первый круг отбора включает добавление реагента для отбора в первом диапазоне концентраций, и указанный второй круг отбора включает добавление реагента для отбора во втором диапазоне концентраций, при этом второй диапазон концентраций выше первого диапазона концентраций, и при этом второй диапазон концентраций по меньшей мере в 1,5 раза выше первого диапазона концентраций; и
выделение клеток, экспрессирующих фенотип, под селективным давлением.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что введение осуществляют путем электропорации.
30. Способ по п. 28 или 29, отличающийся тем, что отбор осуществляют путем повышения селективного давления посредством селективной маркерной кассеты.
31. Способ по любому из пп. 28-29, отличающийся тем, что реагент для отбора включает агент для отбора.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что агент для отбора представляет собой метотрексат.
33. Способ по любому из пп. 28-29 и 32, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 50 нМ - 100 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 75 до 150 нМ.
34. Способ по любому из пп. 28-29 и 32, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 75 нМ - 150 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 112,5 до 225 нМ.
35. Способ по любому из пп. 28-29 и 32, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 300 нМ - 675 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 450 до 1012 нМ.
36. Способ по любому из пп. 28-29 и 32, отличающийся тем, что первый круг отбора включает подвергание клеток воздействию агента для отбора в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней перед вторым кругом отбора.
37. Способ по любому из пп. 28-29 и 32, отличающийся тем, что второй круг отбора включает подвергание клеток воздействию агента для отбора в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней перед выделением.
38. Способ по любому из пп. 28-29 и 32, отличающийся тем, что Т-клетки представляют собой предшественники Т-клеток.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что предшественники Т-клеток представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
40. Генно-инженерные мультиплексированные Т-клетки для адоптивной иммунотерапии Т-клетками, полученные любым из способов по пп. 18-39.
41. Способ лечения, ингибирования или ослабления рака или заболевания у субъекта, при этом указанный способ включает:
введение указанному субъекту модифицированной Т-клетки по п. 40.
42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что субъект представляет собой человека.
43. Способ получения генно-инженерных клеток для адоптивной иммунотерапии Т-клетками, включающий:
получение полинуклеотида для доставки генов по любому из пп. 1-17;
введение указанного полинуклеотида для доставки генов в предшественник Т-клетки;
получение вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица»;
введение указанного вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица», в предшественник Т-клетки;
отбор предшественников Т-клеток, содержащих полинуклеотид для доставки генов; при этом отбор включает первый круг отбора и второй круг отбора, при этом указанный первый круг отбора включает добавление реагента для отбора в первом диапазоне концентраций, и указанный второй круг отбора включает добавление реагента для отбора во втором диапазоне концентраций, при этом второй диапазон концентраций выше первого диапазона концентраций, и при этом второй диапазон концентраций по меньшей мере в 1,5 раза выше первого диапазона концентраций; и
выделение предшественников Т-клеток, экспрессирующих фенотип, под селективным давлением.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что введение осуществляют путем электропорации.
45. Способ по п. 43 или 44, отличающийся тем, что отбор осуществляют путем повышения селективного давления посредством селективной маркерной кассеты.
46. Способ по любому из пп. 43-44, отличающийся тем, что реагент для отбора включает агент для отбора.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что агент для отбора представляет собой метотрексат.
48. Способ по любому из пп. 43-44 и 47, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 50 нМ - 100 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 75 до 150 нМ.
49. Способ по любому из пп. 43-44 и 47, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 75 нМ - 150 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 112,5 до 225 нМ.
50. Способ по любому из пп. 43-44 и 47, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 300 нМ - 675 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 450 до 1012 нМ.
51. Способ по любому из пп. 43-44 и 47, отличающийся тем, что первый круг отбора включает подвергание Т-клеток воздействию агента для отбора в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней перед вторым кругом отбора.
52. Способ по любому из пп. 43-44 и 47, отличающийся тем, что второй круг отбора включает подвергание предшественников Т-клеток воздействию агента для отбора в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, или любого времени в диапазоне моментов времени, определяемом любыми двумя из вышеуказанных моментов времени, перед выделением.
53. Способ по любому из пп. 43-44 и 47, отличающийся тем, что предшественник Т-клетки представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
54. Способ увеличения выработки белка в предшественнике Т-клетки, включающий:
получение полинуклеотида по любому из пп. 1-17;
введение указанного полинуклеотида в предшественник Т-клетки;
получение вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица»;
введение указанного вектора, кодирующего транспозазу «Спящая красавица», в предшественник Т-клетки;
отбор предшественников Т-клеток, содержащих полинуклеотид для доставки генов; при этом отбор включает первый круг отбора и второй круг отбора, при этом указанный первый круг отбора включает добавление реагента для отбора в первом диапазоне концентраций, и указанный второй круг отбора включает добавление реагента для отбора во втором диапазоне концентраций, при этом второй диапазон концентраций выше первого диапазона концентраций, и при этом второй диапазон концентраций по меньшей мере в 1,5 раза выше первого диапазона концентраций; и
выделение предшественников Т-клеток, экспрессирующих фенотип, под селективным давлением.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что введение осуществляют путем электропорации.
56. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что отбор осуществляют путем повышения селективного давления посредством селективной маркерной кассеты.
57. Способ по любому из пп. 54-55, отличающийся тем, что реагент для отбора включает агент для отбора.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что агент для отбора представляет собой метотрексат.
59. Способ по любому из пп. 54-55 и 58, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 50 нМ - 100 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 75 до 150 нМ.
60. Способ по любому из пп. 54-55 и 58, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 75 нМ - 150 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 112,5 до 225 нМ.
61. Способ по любому из пп. 54-55 и 58, отличающийся тем, что первый диапазон концентраций составляет по меньшей мере 300 нМ - 675 нМ, и второй диапазон концентраций составляет по меньшей мере от 450 до 1012 нМ.
62. Способ по любому из пп. 54-55 и 58, отличающийся тем, что первый круг отбора включает подвергание клеток воздействию агента для отбора в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней перед вторым кругом отбора.
63. Способ по любому из пп. 54-55 и 58, отличающийся тем, что второй круг отбора включает подвергание клеток воздействию агента для отбора в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней перед выделением.
64. Способ по любому из пп. 54-55 и 58, отличающийся тем, что предшественники Т-клеток представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
Наверх