Новые клетки позвоночных и способы рекомбинантной экспрессии интересующего полипептида - заявка 2016145928 на патент на изобретение в РФ

1. Выделенная клетка позвоночного, подходящая для рекомбинантной экспрессии интересующего полипептида, где клетку позвоночного изменяют для ухудшения эффекта матриптазы, где эффект матриптазы ухудшен, т.к. в указанной клетке снижают или устраняют функциональную экспрессию гена матриптазы посредством нокаута гена, мутации гена, делеции гена, сайленсинга гена или комбинации любых из указанного выше, и где клетка позвоночного содержит по меньшей мере один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, где клетка позвоночного секретирует интересующий полипептид.
2. Выделенная клетка позвоночного по п. 1, где геном клетки позвоночного изменяют для ухудшения функции эндогенной протеазы матриптазы, и/или где по меньшей мере одну или все копии гена матриптазы подвергают делеции или функционально инактивируют.
3. Выделенная клетка позвоночного по п. 2, имеющая один или несколько из следующих признаков
a) клетка позвоночного содержит одну или несколько мутаций по меньшей мере в одной копии или всех копиях гена матриптазы для получения нефункционального или менее функционального продукта экспрессии; и/или
b) клетка позвоночного содержит одну или несколько мутаций в промоторе, 5'UTR, 3'UTR и/или других регуляторных элементах гена матриптазы.
4. Выделенная клетка позвоночного по п. 3, где указанная одна или несколько мутаций содержатся в кодирующей области гена матриптазы и приводят к нефункциональному или менее функциональному продукту экспрессии, где, необязательно, одна или несколько мутаций содержатся в полинуклеотидной последовательности гена матриптазы, кодирующей экзон 2 матриптазы, или где одна или несколько мутаций содержатся в полинуклеотидной последовательности гена матриптазы, кодирующей, по меньшей мере, часть каталитического домена матриптазы, при этом получают нефункциональный или менее функциональный продукт экспрессии.
5. Выделенная клетка позвоночного по п. 1, где неизмененная эндогенная матриптаза обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности по отношению к одной или нескольким аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 1-5, в качестве референсного белка матриптазы и имеет ту же протеолитическую активность, что и указанный референсный белок матриптаза.
6. Выделенная клетка позвоночного по п. 1, где клетка позвоночного имеет одну или несколько из следующих характеристик:
a) клетка позвоночного является клеткой млекопитающего;
b) клетка позвоночного является клеткой человека;
c) клетка позвоночного является клеткой грызуна;
d) клетка позвоночного является клеткой хомяка;
e) клетка позвоночного является клеткой CHO; и/или
f) клетка позвоночного является клеткой млекопитающего, полученной в виде клона клеток или линии клеток.
7. Выделенная клетка позвоночного по п. 1, где клетка позвоночного является клеткой CHO, содержащей одну или несколько мутаций со сдвигом рамки считывания в экзоне 2 одного или обоих аллелей гена матриптазы.
8. Выделенная клетка позвоночного по п. 1, где интересующий полипептид имеет одну или несколько из следующих характеристик:
a) он является терапевтически активным или диагностическим полипептидом;
b) он подвержен клиппированию протеазами;
c) он содержит по меньшей мере один участок клиппирования матриптазой;
d) он является гликополипептидом; и/или
e) он выбран из группы, состоящей из гликопротеинов, антител, не-IgG белков, Fc-слитых белков, Fab-фрагментов, белковых комплексов, пептидаз, сигнальных пептидов, нанотел, факторов роста, гормонов, цитокинов, факторов крови и ферментов.
9. Выделенная клетка позвоночного по п. 1, где по меньшей мере один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, встраивают в геном указанной клетки, и где необязательно по меньшей мере один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий селективный маркер или репортерный полипептид, дополнительно встраивают в геном указанной клетки.
10. Способ получения клетки позвоночного по п. 1, включающий изменение клетки позвоночного для ухудшения эффекта матриптазы посредством снижения или устранения функциональной экспрессии гена матриптазы в указанной клетке посредством нокаута гена, мутации гена, делеции гена, сайленсинга гена или комбинации любых из указанного выше, и встраивание полинуклеотида, кодирующего интересующий полипептид, где указанный интересующий полипептид секретируется клеткой позвоночного.
11. Способ рекомбинантного получения интересующего полипептида, включающий
(a) культивирование клеток-хозяев позвоночных по п. 1 в условиях, делающих возможной экспрессию и секрецию интересующего полипептида в среде для культивирования клеток;
(b) выделение интересующего полипептида из среды для культивирования клеток; и
(c) необязательно, обработку выделенного интересующего полипептида.
12. Способ селекции клетки-хозяина, рекомбинантно экспрессирующей интересующий полипептид, включающий
(a) получение клеток позвоночных по п. 1 в качестве клеток-хозяев; и
(b) селекцию одной или нескольких клеток-хозяев, экспрессирующих интересующий полипептид;
где, необязательно, этап (a) включает трансфекцию клеток позвоночных, в которых функция эндогенной протеазы матриптазы ухудшена с использованием по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего интересующий полипептид, для получения клеток-хозяев позвоночных по п. 1.
13. Способ по п. 12, имеющий одну или несколько из следующих характеристик
a) клетки позвоночных являются клетками млекопитающих;
b) указанные клетки-хозяева, полученные на этапе (a), дополнительно содержат по меньшей мере один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, и этап (b) включает культивирование указанного множества клеток-хозяев в условиях, селективных для селективного маркера;
c) полинуклеотиды встраивают в клетки позвоночных посредством трансфекции одного или нескольких экспрессирующих векторов;
d) этап (b) включает один или несколько этапов селекции; и/или
e) этап (b) включает осуществление селекции на основе проточной цитометрии.
14. Способ селекции клетки позвоночного для рекомбинантного получения интересующего полипептида, включающий анализ того, является ли эндогенная протеаза матриптаза функционально экспрессирующейся в клетке позвоночного, и селекцию клетки позвоночного, в которой эффект такой эндогенной матриптазы ухудшают посредством снижения или устранения функциональной экспрессии гена матриптазы посредством нокаута гена, мутации гена, делеции гена, сайленсинга гена или комбинации любых из указанного выше для рекомбинантного получения интересующего полипептида.
15. Применение клетки позвоночного для рекомбинантного получения интересующего полипептида, секретируемого клеткой позвоночного, где применяемую клетку изменяют для ухудшения эффекта эндогенной протеазы матриптазы, где эффект матриптазы ухудшен, т.к. в указанной клетке снижают или устраняют функциональную экспрессию гена матриптазы посредством нокаута гена, мутации гена, делеции гена, сайленсинга гена или комбинации любых из указанного выше, где, необязательно, клетка позвоночного имеет одну или несколько характеристик по п. 2.
Наверх