Способ отбора долгосрочно продуцирующей клетки с применением ацилирования гистонов в качестве маркеров - заявка 2016149090 на патент на изобретение в РФ

1. Способ отбора клеточного клона/клеточной линии, которая содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид/ функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, которая имеет нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO 01, при этом указанный способ включает следующие этапы:
a) определение уровня ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3 (Н3ас/Н3) вблизи промоторной нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 01, для первого множества клеточных клонов/клеточных линий, и
b) определение частоты метилирования CpG-сайта в позиции 425 в SEQ ID NO 01 для второго множества клеточных клонов/клеточных линий, и
c) отбор клеточного клона/клеточной линии, которая содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO 01, которая имеет уровень ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3, определенный на этапе а), более 0,5, и которая имеет частоту метилирования CpG-сайта в позиции 425, определенную на этапе b), менее 5%.
2. Способ отбора клеточного клона/клеточной линии, которая содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, которая имеет нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO 01, при этом указанный способ включает следующие этапы:
а) определение для каждого клеточного клона/клеточной линии первого множества клеточных клонов/клеточных линий, где каждый клон/клеточная линия содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO 01, среднего уровня ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3 (Н3ас/Н3) вблизи промоторной нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 01, на основании уровня ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3 (Н3ас/Н3), определенного по меньшей мере в 10 клетках, полученных при культивировании каждого клеточного клона/клеточной линии, и
b) определение для каждого клеточного клона/клеточной линии второго множества клеточных клонов/клеточных линий, где каждый клеточный клон/клеточная линия содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 01, средней частоты метилирования CpG-сайта в позиции 425 в SEQ ID NO 01, на основании метилирования, определенного по меньшей мере в 10 клетках, полученных при культивировании каждого клеточного клона/клеточной линии, и
c) отбор клеточного клона/клеточной линии, которая имеет средний уровень ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3, равный 0,5 или более, и которая имеет частоту метилирования в позиции 425 менее 5%.
3. Способ по п. 1 или 2, где указанный полипептид представляет собой легкую цепь антитела, и способ дополнительно включает следующий этап:
ab) определение числа копий стабильно интегрированных экспрессионных кассет легкой цепи,
где этап с) представляет собой:
отбор клеточного клона/клеточной линии, которая имеет уровень ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3, определенный на этапе а), более 0,5, которая имеет частоту метилирования CpG-сайта в позиции 425, определенную на этапе b), менее 5%, и которая имеет число копий стабильно интегрированных экспрессионных кассет легкой цепи, определенное на этапе ab), равное 10 или менее.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором первое множество клеток и второе множество клеток являются одним и тем же множеством клеток.
5. Способ по п. 1 или 2, в котором определение уровня ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3 (Н3ас/Н3) включает следующие этапы:
1) выделение хроматина из каждого клеточного клона/клеточной линии,
2) обработка первой аликвоты хроматина антителом, специфическим в отношении ацетилирования гистона 3 или гистона 3, и формирование преципитата "антитело - хроматин", и обработка второй аликвоты хроматина антителом, специфическим в отношении гистона 3, и формирование преципитата "антитело - хроматин",
3) амплификация геномной ДНК из третьей необработанной аликвоты хроматина и из первой и второй обработанных аликвот путем количественной ПЦР в режиме реального времени,
4) определение с помощью результата, полученного на этапе 3), уровня ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3.
6. Способ по п. 1 или 2, где определение частоты метилирования включает следующие этапы:
1) выделение ДНК из каждого клеточного клона/клеточной линии,
2) проведение для каждой выделенной ДНК отдельной полимеразной цепной реакции, специфической в отношении метилирования,
3) определение с помощью результата, полученного на этапе 2), частоты метилирования.
7. Способ по п. 6, в котором этап 2) представляет собой:
2) проведение для каждой выделенной ДНК отдельной полимеразной цепной реакции с использованием праймера, специфического в отношении метилирования, и универсального праймера.
8. Способ по п. 7, в котором универсальные праймеры имеют последовательности SEQ ID NO 09 и 11, а праймеры, специфические в отношении метилирования, имеют последовательности SEQ ID NO 11 и 18.
9. Способ по п. 1 или 2, в котором уровень ацетилирования гистона 3 относительно уровня гистона 3 (Н3ас/Н3) нормализован по референсному гену.
10. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что референсный ген представляет собой Gusb.
11. Способ по п. 1 или 2, в котором второе множество клеточных клонов/клеточных линий содержит по меньшей мере один клеточный клон/клеточную линию, также включенную в первое множество клеточных клонов/клеточных линий.
12. Способ по п. 11, в котором второе множество клеточных клонов/клеточных линий идентично первому множеству клеточных клонов/клеточных линий.
13. Способ по п. 1 или 2, в котором клеточный клон/клеточная линия представляет собой клеточный клон/клеточную линию клеток яичника китайского хомячка (СНО).
14. Способ по п. 1 или 2, где указанный полипептид представляет собой антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела.
15. Способ по п. 14, в котором антитело представляет собой биспецифическое антитело.
16. Способ получения полипептида, который включает следующие этапы:
a) отбор клеточного клона/клеточной линии с помощью способа по любому из пп. 1-15,
b) культивирование отобранного клеточного клона/клеточной линии, и
c) выделение полипептида из среды культивирования и/или клеточного клона/клеточной линии и, таким образом, получение полипептида.
17. Способ по п. 16, который включает перед этапом а) следующие этапы:
а-3) получение клетки млекопитающего, не являющейся клеткой человека,
а-2) трансфекция полученной клетки нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеиновую кислоту, содержащую структурный ген, кодирующий полипептид, функционально связанный с промоторной нуклеиновой кислотой, которая имеет нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO 01,
а-1) i) возможно, культивирование трансфицированного клеточного клона/клеточной линии в присутствии селективного агента, ii) одиночное депонирование трансфицированных клеток, и iii) культивирование одиночных депонированных трансфицированных клеток в присутствии селективного агента.
Наверх