Способы получения рамнолипидов - заявка 2016149604 на патент на изобретение в РФ

1. Способ получения по меньшей мере одного рамнолипида, предусматривающий:
приведение рекомбинантной клетки в контакт со средой, содержащей источник углерода; и
культивирование клетки в подходящих условиях для получения рамнолипида из источника углерода при помощи клетки,
где рекомбинантная клетка генетически модифицирована таким образом, что по сравнению с клеткой дикого типа данная клетка характеризуется повышенной активностью по меньшей мере одного из ферментов E1, E2 и E3, где фермент E1 представляет собой α/β-гидролазу, фермент E2 представляет собой рамнозилтрансферазу I, и фермент E3 представляет собой рамнозилтрансферазу II, и
где источник углерода представляет собой C4-молекулу.
2. Способ по п. 1, где C4-молекула выбрана из группы, включающей бутан, 1-бутанол, 2-бутанол, 1-бутаналь, бутанон, масляную кислоту и их комбинации.
3. Способ по п. 1 или п. 2, где клетка генетически модифицирована таким образом, что по сравнению с клеткой дикого типа данная клетка характеризуется повышенной активностью фермента оксидоредуктазы.
4. Способ по п. 3, где оксидоредуктаза выбрана из группы, включающей оксидоредуктазу типа alkB, монооксигеназу и NAD(P)H-зависимую алкогольдегидрогеназу (ADH).
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантная клетка характеризуется повышенной активностью ферментов E1, E2, E3 и оксидоредуктазы по сравнению с клеткой дикого типа, и где C4-молекула представляет собой бутан.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где среда содержит по меньшей мере 40% по весу C4-молекул от общего содержания углерода в среде.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где
фермент E1 способен катализировать превращение 3-гидроксиалканоил-ACP через 3-гидроксиалканоил-3-гидроксиалкановую кислоту-ACP в гидроксиалканоил-3-гидроксиалкановую кислоту,
фермент E2 способен катализировать превращение dTDP-рамнозы и 3-гидроксиалканоил-3-гидроксиалканоата в α-L-рамнопиранозил-3-гидроксиалканоил-3-гидроксиалканоат; и
фермент E3 способен катализировать превращение dTDP-рамнозы и α-L-рамнопиранозил-3-гидроксиалканоил-3-гидроксиалканоата в α-L-рамнопиранозил-(1-2)-α-L-рамнопиранозил-3-гидроксиалканоил-3-гидроксиалканоат.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где
фермент E1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и их фрагменты,
фермент E2 выбран из группы, включающей SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и их фрагменты, и
фермент E3 выбран из группы, включающей SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и их фрагменты,
где фрагмент содержит полипептидную последовательность, в которой не более 25% аминокислотных радикалов модифицированы посредством делеции, вставки, замены или их комбинации по сравнению с последовательностью соответствующего фермента, и при этом фрагмент характеризуется по меньшей мере 10% ферментной активности соответствующего фермента.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где клетка выбрана из рода, относящегося к группе, включающей Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium и Cupriavidus.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где клетка выбрана из группы, включающей P. putida GPp121, P. putida GPp122, P. putida GPp123, P. putida GPp124 и P. putida GPp104, P. putida KT42C1, P. putida KTOY01 или P. putida KTOY02.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где рамнолипид представлен общей формулой (I),
формула (I),
где
m = 2, 1 или 0, в частности 1 или 0,
n = 1 или 0, в частности 1,
R1 и R2 независимо друг от друга представляют собой одинаковые или различные органические радикалы, имеющие от 2 до 24 атомов углерода, необязательно разветвленные, необязательно замещенные, гидроксизамещенные, необязательно ненасыщенные или необязательно моно-, ди- или триненасыщенные алкильные радикалы.
12. Клетка, способная к образованию по меньшей мере одного рамнолипида из C4-молекулы, где клетка генетически модифицирована таким образом, что по сравнению с клеткой дикого типа данная клетка характеризуется повышенной активностью фермента оксидоредуктазы и по меньшей мере одного из ферментов E1, E2 и E3, где фермент E1 представляет собой α/β-гидролазу, фермент E2 представляет собой рамнозилтрансферазу I, и фермент E3 представляет собой рамнозилтрансферазу II.
13. Клетка по п. 12, где C4-молекула выбрана из группы, включающей бутан, 1-бутанол, 2-бутанол, 1-бутаналь, бутанон, масляную кислоту и их комбинации.
14. 14. Клетка по п. 12 или п. 13, где
оксидоредуктаза выбрана из группы, включающей оксидоредуктазу типа alkB, монооксигеназу и NAD(P)H-зависимую алкогольдегидрогеназу (ADH),
фермент E1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и их фрагменты,
фермент E2 выбран из группы, включающей SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и их фрагменты, и
фермент E3 выбран из группы, включающей SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15,
и где фрагмент содержит полипептидную последовательность, в которой не более 25% аминокислотных радикалов модифицированы посредством делеции, вставки, замены или их комбинации по сравнению с последовательностью соответствующего фермента, и при этом фрагмент характеризуется по меньшей мере 10% ферментной активности соответствующего фермента.
15. Клетка по любому из пп. 12-14, где клетка выбрана из рода, относящегося к группе, включающей Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium и Cupriavidus.
Наверх