Способ подготовки дендритной клетки наполненой антигеном - заявка 2016150446 на патент на изобретение в РФ

1. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, отличающийся тем, что: его стадии представляют собой:
добавление бессывороточной клеточной культуральной среды, содержащей GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и IL-4 (интерлейкин 4), к мононуклеарным клеткам и размещение в инкубаторе при 37°С с 5% CO2 для выращивания;
через 5 суток добавление катионных липосом, которые инкапсулируют антиген-мишень, для выращивания в течение 8-24 часов, и затем могут быть получены дендритные клетки, нагруженные антигеном-мишенью.
2. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 1, отличающийся тем, что: катионная липосома представляет собой катионный липосомный комплекс, модифицированный маннозой.
3. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 1, отличающийся тем, что: катионную липосому получают путем сочетания маннозы или маннозида с дериватизированным полиэтиленгликолем фосфолипидом с получением дериватизированного полиэтиленгликолем фосфолипида, модифицированного маннозой; растворяют катионный липид и дериватизированный полиэтиленгликолем фосфолипид, модифицированный маннозой, в смешанном растворителе хлороформа и метанола, соответственно, после смешивания с получением жидкой смеси; упаривают в роторном испарителе жидкую смесь при постоянном потоке азота или потоке инертного газа с образованием однородной пленки; добавляют буферный раствор PBS (фосфатно-буферный раствор), содержащий опухолевый антиген, после сушки в вакууме и размещают при 4°С для ультразвуковой обработки для гидратации; получают катионную липосому после экструдирования через пленку; где нагружающее количество опухолевого антигена составляет 1-500 г антигена/моль липосомы.
4. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 3, отличающийся тем, что: диапазон мольного количественного отношения катионного липида к дериватизированному полиэтиленгликолем фосфолипиду, модифицированному маннозой, составляет от 1:1 до 1:10.
5. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 3 или 4, отличающийся тем, что: катионный липид представляет собой любой из бромида дидецилдиметиламмония, диолеоилтриметиламмонийпропана, хлорида диолеоилпропилтриметиламмония, 3-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерина и диолеиловый эфир-фосфатидилхолина.
6. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 1, отличающийся тем, что: антиген-мишень представляет собой один или более чем один опухолевый антигенный белок или полипептид, имеющий различные эпитопы.
7. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 6, отличающийся тем, что: антиген может быть выбран из группы, состоящей из лизата опухолевых клеток, аутологического или аллогенного опухолевого антигенного белка, полипептида или белкового продукта генетической инженерии и синтетического антигенного полипептида.
8. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 6, отличающийся тем, что: антиген представляет собой антиген HBsAg (поверхностный антиген гепатита В), антигены опухолевой ткани, электронейтральный полипептидный антиген, электроотрицательный полипептидный антиген сурвивин или антигенный белок OVA (овальбумин).
9. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 1, отличающийся тем, что: клетки DC (дендритные клетки) включают клетки DC, индуцированные из мононуклеарных клеток периферической крови, клетки DC, индуцированные из гемопоэтических стволовых клеток и стволовых клеток пуповинной крови.
10. Способ получения дендритных клеток, эффективно нагруженных антигенами, по п. 1, отличающийся тем, что: человеческие мононуклеарные клетки периферической крови суспендируют в базальной среде и затем инокулируют в клеточные культуральные планшеты для прикрепления культуры в течение 1-2 часов при 37°С в инкубаторе; после этого неприкрепившиеся клетки удаляют, бессывороточную клеточную культуральную среду, содержащую GM-CSF и IL-4, добавляют к прикрепившимся клеткам для выращивания при 37°С с 5% CO2 при насыщенной влажности для осуществления индукции клеток DC; на третьи сутки культуральную среду для клеток DC добавляют в планшет для культуры клеток DC в половинном количестве; на пятые сутки инкапсулированный в липосоме антиген добавляют к клеткам DC, выращивают в течение 8-24 часов, где корректирующая доза антигена составляет 1-50 мкг/мл, и получают клетки DC, нагруженные опухолевыми антигенами;
предпочтительно, бессывороточная клеточная культуральная среда содержит 25-500 нг/мл GM-CSF и 5-100 нг/мл IL-4.
Наверх