Белки слияния на основе ox40l и пути их применения - заявка 2016150096 на патент на изобретение в РФ

1. Одноцепочечная полипептидная субъединица, содержащая Fc-домен IgG4 человека; функциональный тримеризационный домен и рецептор-связывающий домен OX40L, где полипептидная субъединица может самособираться в тримерный или гексамерный белок.
2. Полипептидная субъединица по п. 1, содержащая, от амино-конца к карбокси-концу, Fc-домен IgG4 человека, за которым расположен тримеризационный домен, за которым расположен рецептор-связывающий домен OX40L.
3. Полипептидная субъединица по п. 2, где карбокси-конец Fc-домена IgG4 человека слит непосредственно с амино-концом тримеризационного домена, а карбокси-конец тримеризационного домена слит непосредственно с амино-концом рецептор-связывающего домена OX40L.
4. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-3, где Fc-домен IgG4 содержит шарнирную область IgG4.
5. Полипептидная субъединица по п. 4, где шарнирная область содержит мутацию, которая обеспечивает полное образование дисульфидных связей между тяжелыми цепями.
6. Полипептидная субъединица по п. 5, где мутация включает в себя мутацию по типу замены серина на пролин в положении 228 (S228P) согласно EU-нумерации.
7. Полипептидная субъединица по п. 5 или 6, где шарнирная область содержит аминокислоты 1-12 из SEQ ID NO: 4.
8. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-7, где Fc-домен IgG4 человека дополнительно содержит CH2-область.
9. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-8, где Fc-домен IgG4 человека дополнительно содержит CH3-область.
10. Полипептидная субъединица по п. 9, где Fc-домен IgG4 человека содержит аминокислоты 1-229 из SEQ ID NO: 4.
11. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-10, где тримеризационный домен включает в себя суперскрученный альфа-спиральный домен, домен "лейциновая застежка" или их комбинацию.
12. Полипептидная субъединица по п. 11, где тримеризационный домен получен из TRAF2; тромбоспондина 1; матрилина-4; CMP (матрилина-1); HSF1 или кубилина.
13. Полипептидная субъединица по п. 12, где тримеризационный домен содержит аминокислоты 310-349 TRAF2 человека (SEQ ID NO: 2).
14. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-13, где рецептор-связывающий домен OX40L содержит аминокислоты 51-183 OX40L человека (SEQ ID NO: 1).
15. Полипептидная субъединица по п. 14, где гексамерный белок, собранный из шести полипептидных субъединиц, может специфично связываться с OX40 человека.
16. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-15, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
17. Полипептидная субъединица по любому из пп. 1-16, дополнительно содержащая связанное гетерологичное средство.
18. Полипептидная субъединица по п. 17, где гетерологичное средство представляет собой гетерологичный полипептид и является слитым с полипептидной субъединицей посредством пептидной связи.
19. Полипептидная субъединица по п. 18, где гетерологичный полипептид слит с N-концом Fc-домена IgG4, слит с C-концом рецептор-связывающего домена OX40L, слит с C-концом Fc-домена IgG4 и N-концом тримеризационного домена или слит с C-концом тримеризационного домена и N-концом рецептор-связывающего домена OX40L.
20. Полипептидная субъединица по п. 17, где гетерологичное средство химически конъюгировано с полипептидной субъединицей.
21. Полипептидная субъединица по любому из пп. 17-20, где гетерологичное средство включает в себя цитотоксическую молекулу, стабилизирующее средство, модификатор иммунного ответа или детектируемое средство.
22. Тримерный белок, содержащий три полипептидные субъединицы по любому из пп. 1-21.
23. Гексамерный белок, содержащий шесть полипептидных субъединиц по любому из пп. 1-21.
24. Гексамерный белок по п. 23, где каждая из шести полипептидных субъединиц содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
25. Гексамерный белок по п. 24, включающий в себя белок слияния на основе OX40L и IgG4P.
26. Гексамерный белок по любому из пп. 23-25, который специфично связывается с OX40, экспрессируемым на активированных CD4+ или CD8+ Т-клетках человека, яванского макака, макака-резуса или любой их комбинации.
27. Гексамерный белок по п. 26, который может специфично связываться с OX40, экспрессируемым на первичных активированных CD4+ Т-клетках человека, яванского макака, макака-резуса или любой их комбинации.
28. Гексамерный белок по п. 26 или 27, где аффинность связывания с OX40 человека, экспрессируемым на первичных активированных CD4+ Т-клетках человека, составляет от приблизительно 1,0 пМ до приблизительно 8,0 пМ согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
29. Гексамерный белок по п. 28, где аффинность связывания составляет приблизительно 3,6 пМ.
30. Гексамерный белок по п. 26 или 27, который может обеспечивать 20% занятость рецепторов на первичных активированных CD4+ Т-клетках человека (EC20) при концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0 пМ, 50% занятость рецепторов на первичных активированных CD4+ Т-клетках человека (EC50) при концентрации от приблизительно 3,0 до приблизительно 10 пМ и 90% занятость рецепторов на первичных активированных CD4+ Т-клетках человека (EC90) при концентрации от приблизительно 35 до приблизительно 70 пМ согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
31. Гексамерный белок по п. 30, где EC20 составляет приблизительно 1,8 пМ, EC50 составляет приблизительно 6,6 пМ, и EC90 составляет приблизительно 53 пМ.
32. Гексамерный белок по п. 26, где аффинность связывания с OX40 человека, экспрессируемым на сверхэкспрессирующих OX40 клетках Jurkat, составляет от приблизительно 1,0 пМ до приблизительно 24 пМ согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
33. Гексамерный белок по п. 32, где аффинность связывания составляет приблизительно 12 пМ.
34. Гексамерный белок по п. 26, который может обеспечивать EC20 на сверхэкспрессирующих OX40 клетках Jurkat при концентрации от приблизительно 1,0 до приблизительно 15 пМ, EC50 на сверхэкспрессирующих OX40 клетках Jurkat при концентрации от приблизительно 1,0 до приблизительно 40 пМ и EC90 на сверхэкспрессирующих OX40 клетках Jurkat при концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 100 пМ согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
35. Гексамерный белок по п. 34, где EC20 составляет приблизительно 7,2 пМ, EC50 составляет приблизительно 16 пМ, и EC90 составляет приблизительно 57 пМ.
36. Гексамерный белок по п. 26 или 27, где аффинность связывания с OX40 яванского макака, экспрессируемым на первичных активированных CD4+ Т-клетках яванского макака, составляет от приблизительно 1,0 пМ до приблизительно 50 пМ согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
37. Гексамерный белок по п. 36, где аффинность связывания составляет приблизительно 24 пМ.
38. Гексамерный белок по п. 26 или 27, где аффинность связывания с OX40 макака-резуса, экспрессируемым на первичных активированных CD4+ Т-клетках макака-резуса, составляет от приблизительно 1,0 пМ до приблизительно 50 пМ согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
39. Гексамерный белок по п. 38, где аффинность связывания составляет приблизительно 21 пМ.
40. Гексамерный белок по любому из пп. 23-39, который индуцирует дозозависимую пролиферацию активированных CD4+ Т-клеток и дозозависимое высвобождение цитокинов активированными CD4+ Т-клетками в анализе с применением планшетов.
41. Гексамерный белок по п. 40, где 20% максимального пролиферативного ответа (EC20) может быть достигнуто для первичных активированных CD4+ Т-клеток человека при концентрации гексамерного белка от приблизительно 1,0 пМ до приблизительно 15 пМ, 50% максимального пролиферативного ответа (EC50) может быть достигнуто для первичных активированных CD4+ Т-клеток человека при концентрации гексамерного белка от приблизительно 5,0 пМ до приблизительно 25 пМ, и 90% максимального пролиферативного ответа (EC90) может быть достигнуто для первичных активированных CD4+ Т-клеток человека при концентрации гексамерного белка от приблизительно 50 пМ до приблизительно 65 пМ, во всех случаях согласно измерению с помощью проточной цитометрии.
42. Гексамерный белок по п. 41, где EC20 составляет приблизительно 8,0 пМ, EC50 составляет приблизительно 14 пМ, и EC90 составляет приблизительно 57 пМ.
43. Гексамерный белок по п. 40, где цитокин представляет собой IFNγ, TNFα, IL-5, IL-10, IL-2, IL-4, IL-13, IL-8, IL-12 p70, IL-1β или любую их комбинацию.
44. Гексамерный белок по п. 43, где цитокин представляет собой IFNγ, TNFα, IL-5, IL-10 или любую их комбинацию.
45. Гексамерный белок по любому из пп. 23-39, который может обеспечивать пролиферацию CD4+ T-клеток и высвобождение цитокинов первичными активированными CD4+ Т-клетками яванского макака и первичными активированными CD4+ Т-клетками макака-резуса.
46. Гексамерный белок по любому из пп. 23-39, который может активировать сигнальный путь NFκB в экспрессирующих OX40 Т-клетках в присутствии экспрессирующих FcγR клеток.
47. Гексамерный белок по п. 46, где экспрессирующие OX40 Т-клетки представляют собой экспрессирующие OX40 клетки Jurkat с репортерной системой NFκB-люцифераза, которые вырабатывают люциферазу в ответ на стимуляцию сигнального пути NFκB.
48. Гексамерный белок по п. 46 или 47, где клетки экспрессируют OX40 человека, OX40 яванского макака или OX40 макака-резуса.
49. Гексамерный белок по любому из пп. 23-48, где введение эффективной дозы субъекту, нуждающемуся в лечении рака, может ингибировать рост опухоли у субъекта.
50. Гексамерный белок по п. 49, где ингибирование роста опухоли достигается в присутствии T-клеток.
51. Гексамерный белок по п. 48 или 49, где рост опухоли ингибируется по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70% в сравнении с введением изотипически сходного контроля.
52. Гексамерный белок по любому из пп. 23-51, который может индуцировать пролиферацию активированных экспрессирующих OX40 CD4+ Т-клеток благодаря связыванию с OX40, но практически не запускает комплементзависимую или антителозависимую цитотоксичность в отношении активированных CD4+ Т-клеток.
53. Гексамерный белок по любому из пп. 23-52, который не связывается с C1q или не запускает опосредованную NK-клетками антителозависимую клеточную цитотоксичность в отношении активированных CD4+ Т-клеток.
54. Гексамерный белок по любому из пп. 23-53, где при совместном введении гексамерного белка и вакцинного антигена субъекту может повышаться пролиферация центральных CD4+ Т-клеток памяти (cM).
55. Гексамерный белок по любому из пп. 23-53, где при совместном введении гексамерного белка и вакцинного антигена субъекту может повышаться пролиферация эффекторных CD8+ T-клеток памяти (eM).
56. Гексамерный белок по любому из пп. 23-53, где при совместном введении гексамерного белка и вакцинного антигена субъекту может повышаться пролиферация NK-клеток.
57. Гексамерный белок по любому из пп. 23-53, где при совместном введении гексамерного белка и вакцинного антигена субъекту может повышаться пролиферация B-клеток.
58. Гексамерный белок по любому из пп. 54-57, где пролиферация CD4+ T-клеток cM, пролиферация CD8+ T-клеток eM, пролиферация NK-клеток, пролиферация B-клеток или любая их комбинация измеряется по внутриклеточной экспрессии Ki67 в мононуклеарных клетках периферической крови.
59. Гексамерный белок по любому из пп. 23-58, где при совместном введении гексамерного белка и вакцинного антигена субъекту может увеличиваться антиген-специфический T-клеточный ответ.
60. Гексамерный белок по п. 59, где антиген-специфический T-клеточный ответ измеряется по повышению экспрессии интерферона гамма (IFN-гамма).
61. Гексамерный белок по любому из пп. 23-60, где при совместном введении гексамерного белка и вакцинного антигена субъекту могут повышаться титры антиген-специфичного IgG.
62. Гексамерный белок по п. 61, где антиген представляет собой растворимый гликопротеин F респираторного синцитиального вируса (sF RSV), и где при совместном введении гексамерного белка и антигена RSV субъекту могут повышаться титры антител, нейтрализующих RSV.
63. Композиция, содержащая гексамерный белок по любому из пп. 23-62 и носитель.
64. Полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептидную субъединицу по любому из пп. 1-21 или гексамерный белок по любому из пп. 23-62.
65. Полинуклеотид по п. 64, содержащий SEQ ID NO: 3.
66. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 64 или 65.
67. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 64 или 65 или вектор по п. 66.
68. Способ получения полипептидной субъединицы по любому из пп. 1-21 или гексамерного белка по любому из пп. 23-62, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 67 в условиях, при которых экспрессируются полипептидная субъединица или гексамерный белок, кодируемые полинуклеотидом, и извлечение полипептидной субъединицы или гексамерного белка.
69. Способ содействия выживанию или пролиферации активированных Т-клеток, включающий приведение активированных Т-клеток в контакт с гексамерным белком по любому из пп. 23-62, где гексамерный белок может специфично связываться с OX40 на поверхности Т-клеток.
70. Способ ослабления опосредованной регуляторными T-клетками (Treg) супрессии пролиферации активированных T-клеток, включающий приведение смеси активированных Т-клеток и Treg-клеток в контакт с гексамерным белком по любому из пп. 23-62, где гексамерный белок может специфично связываться с OX40 на поверхности Т-клеток.
71. Способ индукции высвобождения цитокинов активированными Т-клетками, включающий приведение активированных Т-клеток в контакт с гексамерным белком по любому из пп. 23-62, где гексамерный белок может специфично связываться с OX40 на поверхности Т-клеток.
72. Способ по п. 71, где цитокин представляет собой IFNγ, TNFα, IL-5, IL-10, IL-2, IL-4, IL-13, IL-8, IL-12 p70, IL-1β или любую их комбинацию.
73. Способ по п. 72, где цитокин представляет собой IFNγ, TNFα, IL-5, IL-10 или любую их комбинацию.
74. Способ по любому из пп. 69-73, где активированные Т-клетки представляют собой активированные CD4+ Т-клетки, активированные CD8+ Т-клетки или их комбинацию.
75. Способ по любому из п. 74, где активированные CD4+ Т-клетки представляют собой CD4+ Т-клетки человека, CD4+ Т-клетки яванского макака, CD4+ Т-клетки макака-резуса или их комбинацию.
76. Способ содействия активации T-клеток, включающий приведение Т-клеток в контакт с гексамерным белком по любому из пп. 23-62, где гексамерный белок может специфично связываться с OX40 на поверхности Т-клеток.
77. Способ по п. 76, дополнительно включающий перекрестное связывание гексамерного белка посредством взаимодействия Fc-домена IgG4 с клеткой, экспрессирующей FcγR.
78. Способ по п. 77, где клетка, экспрессирующая FcγR, представляет собой B-клетку, моноцит, макрофаг, миелоидную или плазмацитоидную дендритную клетку, фолликулярную дендритную клетку, клетку Лангерганса, эндотелиальную клетку, NK-клетку, активированную T-клетку, нейтрофил, эозинофил, тромбоцит, тучную клетку, CD45+ клетку из первичной опухоли человека или дренирующего или не дренирующего опухоль лимфатического узла, CD45+ клетку из других вторичных или третичных лимфоидных структур или их комбинацию.
79. Способ по любому из пп. 76-78, где активацию Т-клеток можно измерять посредством стимуляции NFκB-пути сигнальной трансдукции.
80. Способ по любому из пп. 76-79, где активированные Т-клетки представляют собой активированные CD4+ Т-клетки, активированные CD8+ Т-клетки или их комбинацию.
81. Способ по п. 80, где активированные CD4+ Т-клетки представляют собой CD4+ Т-клетки человека, CD4+ Т-клетки яванского макака, CD4+ Т-клетки макака-резуса или их комбинацию.
82. Способ по любому из пп. 69-81, где приведение в контакт включает введение эффективного количества гексамерного белка субъекту.
83. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества гексамерного белка по любому из пп. 23-62 или композиции по п. 63.
84. Способ по п. 83, где рак представляет собой солидную опухоль.
85. Способ по п. 83 или 84, где введение гексамерного белка или композиции может ингибировать рост опухоли, может содействовать уменьшению размера опухоли или как то, так и другое.
86. Способ по любому из пп. 83-85, где ингибирования роста опухоли достигают в присутствии T-клеток.
87. Способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества гексамерного белка по любому из пп. 23-62 или композиции по п. 63.
88. Способ по любому из пп. 83-87, где субъектом является субъект-человек.
89. Способ индукции экспрессии ICOS на Т-клетках, включающий приведение Т-клеток в контакт с гексамерным белком по любому из пп. 23-62, где гексамерный белок может специфично связываться с OX40 на поверхности Т-клеток.
90. Способ индукции экспрессии PD-1 на Т-клетках, включающий приведение Т-клеток в контакт с гексамерным белком по любому из пп. 23-62, где гексамерный белок может специфично связываться с OX40 на поверхности Т-клеток.
Наверх