Способ получения препарата белка омр т для моделирования противохолерного иммунитета у экспериментальных животных - заявка 2017100642 на патент на изобретение в РФ

1. Способ получения препарата белка OmpT для моделирования противохолерного иммунитета у экспериментальных животных, включающий следующие стадии:
а) клетки авирулентного штамма V. Cholerae eltor 18950 выращивают на агаре Мартена (рН 7,4) в течение 24 часов при 37°C;
б) смывают клетки физиологическим раствором и осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин при 4°C с последующим механическим разрушением на УЗ-дезинтеграторе в режиме 10 циклов по 20 сек на холоде с 1-минутным интервалом;
в) обрабатывают полученный клеточный лизат ДНК-азой и РНК-азой из расчета 100 мкг на 1 мл лизата в течение 20 мин при 37°C, а неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4°C;
г) подвергают выделенный супернатант ультрацентрифугированию при 26000 об/мин в течение часа при 4°C для получения общего пула мембранных белков;
д) растворяют полученный осадок с мембранными белками в 2 мл 1% Тритона Х-100 в физиологическом растворе при комнатной температуре в течение суток, после этого белки отделяют ультрацентрифугированием при 26000 об/мин в течение часа и отбирают надосадочную жидкость;
е) определяют в надосадочной жидкости количество белка методом Досона;
ж) выделяют белок OmpT из надосадочной жидкости, содержащей мембранные белки, предварительно отдиализированной против 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6) с 0,1% Тритоном Х-100, нанося ее на колонку (15×1 см) с DE-52 целлюлозой, уравновешенной 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6) с 0,1% Тритоном X-100, из расчета 1 мг белка на 1 г целлюлозы;
з) белки, сорбировавшиеся на целлюлозе, элюируют ступенчатым градиентом NaCl от 0 до 0,5 М в том же буфере, причем объем каждого градиента составляют из расчета 30 мл, а фракции собирают в объеме 10 мл, затем разливают в пластиковые пробирки Eppendorf по 1 мл и хранят полученный препарат при -20°C.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракции препарата анализируют на наличие ферментативной активности для идентификации белка, используя протаминсульфат.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активные фракции концентрируют в системе Амикон, затем вычисляют концентрацию белка по оптической плотности раствора, используя формулу Р. Досона.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный препарат проверяют на гомогенность, для этого молекулярный вес и чистоту белка оценивают SDS электрофорезом в 10% ПААГ с маркерами молекулярных весов (40 кДа).
Наверх