Способ амплификации днк на основе внедрения в цепь - заявка 2016145448 на патент на изобретение в РФ

1. Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, включающий приведение указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в контакт с по меньшей мере с одним прямым праймером, по меньшей мере одним обратным праймером и первым и вторым олигонуклеотидами для внедрения в цепь в условиях, способствующих амплификации указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, при этом указанный первый олигонуклеотид для внедрения в цепь делает участок связывания последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, располагающийся в 3'-5' направлении, одноцепочечными для обеспечения связывания указанного прямого праймера, и второй олигонуклеотид для внедрения в цепь делает участок связывания последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, располагающийся в 5'-3' направлении, одноцепочечным для обеспечения связывания указанного обратного праймера.
2. Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей участки связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь в 3'-5' и 5'-3' направлении, включающий приведение указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в контакт с олигонуклеотидом для внедрения в цепь и по меньшей мере одним праймером, способными обеспечивать амплификацию указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, при этом указанный олигонуклеотид для внедрения в цепь делает участки связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь, располагающиеся в 3'-5' и 5'-3' направлении, в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени одноцепочечными для обеспечения связывания указанного по меньшей мере одного праймера.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанные участки связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь, располагающиеся в 3'-5' и 5'-3' направлении, присутствуют в одной и той же цепи последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанные участки связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь, располагающиеся в 3'-5' и 5'-3' направлении, располагаются на противоположных цепях последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанные олигонуклеотиды для внедрения в цепь связаны с противоположными цепями последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, при этом их 3'-концы направлены друг к другу или друг от друга.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный участок связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь, располагающийся в 3'-5' и/или 5'-3' направлении, в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени не перекрывается с участком связывания соответствующего прямого или обратного праймера.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные условия, способствующие амплификации указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, включают присутствие рекомбиназы.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, который осуществляют при изотермических условиях, которые способствуют амплификации указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий приведение указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в контакт с по меньшей мере одним дополнительным олигонуклеотидом для внедрения в цепь.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий приведение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в контакт с олигонуклеотидным зондом.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что участок связывания зонда в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени не перекрывается с участком связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь и/или участком связывания праймера.
12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что участок связывания зонда располагается между 3'-5' и 5'-3' участками связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигонуклеотид для внедрения в цепь и праймер, которому указанный олигонуклеотид позволяет связываться с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, образуют систему резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
14. Способ по любому из пп. 2-13, включающий приведение указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в контакт с по меньшей мере с одним прямым и по меньшей мере с одним обратным праймером, при этом указанный олигонуклеотид для внедрения в цепь делает 3'-5' и 5'-3' участки связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени одноцепочечными для обеспечения возможности связывания указанных прямого и обратного праймера.
15. Способ по любому из пп. 2-13, включающий приведение указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в контакт с одним видом праймера, который может связываться как с 3'-5', так и с 5'-3' участком связывания в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, при этом указанный олигонуклеотид для внедрения в цепь делает 3'-5' и 5'-3' участки связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени одноцепочечными для обеспечения возможности связывания указанного одного вида праймера с его как 3'-5', так и 5'-3' участком связывания.
16. Способ по любому из пп. 2-14, отличающийся тем, что указанные 3'-5' и 5'-3' участки связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь представляют собой адаптерные последовательности.
17. Набор, включающий по меньшей мере один прямой и по меньшей мере один обратный праймер для последовательности нуклеиновой кислоты-мишени и первый и второй олигонуклеотид для внедрения в цепь, которые имеют участки связывания в 3'-5' и 5'-3' направлении в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, соответственно.
18. Набор, содержащий олигонуклеотид для внедрения в цепь и по меньшей мере один праймер и по меньшей мере один ДНК-адаптер, при этом указанный олигонуклеотид для внедрения в цепь может связываться с указанным ДНК-адаптером, если указанный ДНК-адаптер присутствует в 3'-5' и 5'-3' участке связывания последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом указанный по меньшей мере один праймер способен обеспечивать амплификацию указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
19. Набор по п. 18, который содержит по меньшей мере один прямой и по меньшей мере один обратный праймер для указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
20. Набор по п. 18, содержащий один вид праймера, который может связываться как с 3'-5', так и с 5'-3' участком связывания в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
21. Набор по любому из пп. 17-20, отличающийся тем, что указанный 3'-5' и/или 5'-3' участок связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь в указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени не перекрывается с участком связывания соответствующего прямого или обратного праймера.
22. Набор по любому из пп. 17-21, дополнительно содержащий по меньшей мере один олигонуклеотидный зонд.
23. Набор по п. 22, отличающийся тем, что участок связывания зонда в указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени не перекрывается с участком связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь и/или участком связывания праймера.
24. Набор по п. 22 или 23, отличающийся тем, что указанный участок связывания зонда расположен между 3'-5' и 5'-3' участками связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
25. Набор по любому из пп. 17-24, отличающийся тем, что олигонуклеотид для внедрения в цепь и праймер, связывающийся с 3'-5' и/или 5'-3' участком указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, образуют систему FRET.
26. Набор по любому из пп. 17-25, дополнительно содержащий по меньшей мере одну эндонуклеазу рестрикции.
27. Набор по любому из пп. 17-26, содержащий по меньшей мере один дополнительный олигонуклеотид для внедрения в цепь.
28. Набор по п. 18 или пп. 19-27, зависимым от п. 18, дополнительно содержащий по меньшей мере одну ДНК-лигазу.
29. Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей участок с неизвестной последовательностью, включающий создание последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей участки связывания олигонуклеотидов для внедрения в цепь, расположенные в 3'-5' и 5'-3' направлении относительно указанного участка с неизвестной последовательностью, и амплификацию указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени путем осуществления способа по любому из пп. 1-16.
30. Способ определения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей область с неизвестной последовательностью, включающий создание последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей участки связывания вызывающих внедрение в цепь олигонуклеотидов, расположенные в 3'-5' направлении и 5'-3' направлении относительно указанной области с неизвестной последовательностью, амплификацию указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени путем осуществления способа по любому из пп. 1-16 и определение последовательности указанной области с неизвестной последовательностью.
31. Способ по п. 29 или 30, отличающийся тем, что каждый из 3'-5' и 5'-3' участков связывания олигонуклеотида для внедрения в цепь содержит ДНК-адаптерную последовательность, и олигонуклеотид для внедрения в цепь одного вида связывается с указанной ДНК-адаптерной последовательностью как в 3'-5', так и в 5'-3' участке связывания.
Наверх