Способы и композиции для модификации целевого локуса - заявка 2016150168 на патент на изобретение в РФ

1. Способ модификации целевого локуса в клетке, включающий:
(a) обеспечение клетки, содержащей первый целевой локус, который содержит первый полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер, функционально связанный с первым промотором, причем первый полинуклеотид дополнительно содержит первый сайт распознавания для первого нуклеазного агента,
(b) введение в клетку:
(i) первого нуклеазного агента, причем первый нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв на первом сайте распознавания в первом полинуклеотиде, тем самым нарушая экспрессию или активность первого селективного маркера; и
(ii) первого нацеливающего вектора, содержащего первую полинуклеотидную вставку, которая содержит второй полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер, функционально связанный со вторым промотором, при этом первая полинуклеотидная вставка фланкирована первым и вторым гомологичными плечами, соответствующими первому и второму целевым сайтам, расположенным в первом целевом локусе; и
(c) идентификацию модифицированной клетки, содержащей первую полинуклеотидную вставку в первом целевом локусе, при этом модифицированная клетка обладает активностью второго селективного маркера, но не обладает активностью первого селективного маркера, и
при этом первый и второй селективные маркеры являются разными.
2. Способ по п. 1, в котором целевой локус:
(a) находится в геноме клетки; или
(b) расположен в векторе в клетке.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором этап идентификации (с) включает:
(а) культивирование клетки в условиях, позволяющих идентифицировать клетки, не обладающие активностью первого селективного маркера; или
(b) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей первую полинуклеотидную вставку, интегрированную в первый и второй целевые сайты.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором первая полинуклеотидная вставка дополнительно содержит первый интересующий полинуклеотид.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором второй полинуклеотид содержит второй сайт распознавания для второго нуклеазного агента.
6. Способ по п. 5, дополнительно включающий:
(a) введение в клетку, содержащую первую полинуклеотидную вставку, интегрированную в целевой локус,
(i) второго нуклеазного агента, причем второй нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв на втором сайте распознавания во втором полинуклеотиде, тем самым нарушая экспрессию или активность второго селективного маркера; и
(ii) второго нацеливающего вектора, содержащего вторую полинуклеотидную вставку, фланкированную третьим и четвертым гомологичными плечами, соответствующими третьему и четвертому целевым сайтам, расположенным достаточно близко ко второму сайту распознавания; и
(b) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей вторую полинуклеотидную вставку, интегрированную в целевой локус.
7. Способ по п. 6, в котором этап идентификации (b) включает:
(a) культивирование клетки в условиях, позволяющих идентифицировать клетки, не обладающие активностью второго селективного маркера; или
(b) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей вторую полинуклеотидную вставку, интегрированную в третий и четвертый целевые сайты.
8. Способ по п. 6 или 7, в котором второй полинуклеотид, содержащий второй селективный маркер, фланкирован третьим целевым сайтом и четвертым целевым сайтом.
9. Способ по любому из пп. 6-8, в котором вторая полинуклеотидная вставка содержит:
(a) второй интересующий полинуклеотид; и
(b) третий полинуклеотид, кодирующий третий селективный маркер, функционально связанный с третьим активным в клетке промотором, причем третий полинуклеотид содержит третий сайт распознавания для третьего нуклеазного агента.
10. Способ по любому из пп. 5-9, в котором первый нуклеазный агент отличается от второго нуклеазного агента.
11. Способ по п. 9, в котором первый и третий сайты распознавания нуклеазы идентичны друг другу и отличаются от второго сайта распознавания нуклеазы; и при этом первый и третий нуклеазные агенты идентичны друг другу и отличаются от второго нуклеазного агента.
12. Способ по п. 9, в котором первый и третий селективные маркеры являются идентичными.
13. Способ по любому из пп. 9-12, в котором первый, второй или третий селективный маркер придает устойчивость к антибиотику.
14. Способ по п. 13, в котором антибиотик представляет собой G418, гигромицин, бластицидин, неомицин или пуромицин.
15. Способ по любому из пп. 9-12, в котором первый, второй или третий селективный маркер функционально связан с индуцируемым промотором и экспрессия селективного маркера является токсичной для клетки.
16. Способ по п. 15, в котором первый, второй или третий селективный маркер содержит гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK).
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку.
18. Способ по п. 17, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего.
19. Способ по п. 18, в котором клетка млекопитающего представляет собой:
(a) клетку не относящегося к человеку млекопитающего;
(b) плюрипотентную клетку;
(c) человеческую индуцированную плюрипотентную стволовую (ИПС) клетку;
(d) фибробласт человека; или
(e) клетку грызуна.
20. Способ по п. 19, в котором грызун представляет собой крысу или мышь.
21. Способ по п. 19, в котором плюрипотентная клетка представляет собой:
(a) не относящуюся к человеку эмбриональную стволовую (ЭС) клетку;
(b) эмбриональную стволовую (ЭС) клетку мыши или эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы;
(c) гемопоэтическую стволовую клетку; или
(d) нейрональную стволовую клетку.
22. Способ по п. 1, в котором совместное использование первого нацеливающего вектора с первым нуклеазным агентом приводит к повышению эффективности нацеливания по сравнению с использованием только первого нацеливающего вектора.
23. Способ по п. 22, в котором эффективность нацеливания первого нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в 2 раза по сравнению с использованием только первого нацеливающего вектора.
24. Способ по любому из пп. 9-23, в котором первый, второй или третий нуклеазный агент содержит экспрессионную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазный агент, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазный агент, функционально связана с четвертым активным в клетке промотором.
25. Способ по любому из пп. 9-24, в котором первый, второй или третий нуклеазный агент представляет собой:
(a) мРНК, кодирующую нуклеазу;
(b) нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN);
(c) эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN);
(d) мегануклеазу; или
(e) белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК).
26. Способ по п. 25, в котором белок Cas представляет собой Cas9, и при этом гидовая РНК (гРНК) содержит:
(a) РНК коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), (крРНК), нацеленную на первый, второй или третий сайт распознавания, причем первый, второй или третий сайт распознавания непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (РАМ); и
(b) трансактивирующую РНК CRISPR (тракрРНК).
27. Способ по п. 26, в котором целевой локус содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
28. Способ по п. 26, в котором гРНК содержит:
(a) химерную РНК, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3;
(b) крРНК, содержащую SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6; или
(c) тракрРНК, содержащую SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.
29. Способ по любому из пп. 9-28, в котором первый, второй и/или третий сайт распознавания расположен в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или энхансерной области первого, второго или третьего селективного маркера.
30. Способ по любому из пп. 1-29, в котором первый целевой сайт и второй целевой сайт непосредственно смежны с первым сайтом распознавания.
31. Способ по любому из пп. 6-12, в котором:
(a) первый целевой сайт и второй целевой сайт расположены на расстоянии от около 10 нуклеотидов до около 14 т.п.н. от первого сайта распознавания;
(b) третий целевой сайт и четвертый целевой сайт непосредственно смежны со вторым сайтом распознавания; или
(c) третий целевой сайт и четвертый целевой сайт расположены на расстоянии от около 10 нуклеотидов до около 14 т.п.н. от второго сайта распознавания.
32. Способ по любому из пп. 6-31, в котором:
(a) суммарная длина первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча составляет по меньшей мере около 10 т.п.н; и/или
(b) суммарная длина третьего гомологичного плеча и четвертого гомологичного плеча составляет по меньшей мере около 10 т.п.н.
33. Способ по любому из пп. 6-32, в котором:
(a) длина первой полинуклеотидной вставки находится в диапазоне от около 5 т.п.н. до около 300 т.п.н.; и/или
(b) длина второй полинуклеотидной вставки находится в диапазоне от около 5 т.п.н. до около 300 т.п.н.
34. Способ по любому из пп. 6-33, в котором:
(a) интеграция первой полинуклеотидной вставки в целевой локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, перестановке доменов, перестановке экзонов, перестановке интронов, перестановке регуляторных последовательностей, перестановке генов или их комбинации; и/или
(b) интеграция второй полинуклеотидной вставки в целевой локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, перестановке доменов, перестановке экзонов, перестановке интронов, перестановке регуляторных последовательностей, перестановке генов или их комбинации.
35. Способ по любому из пп. 6-34, в котором:
(а) первая полинуклеотидная вставка содержит:
(i) интересующий полинуклеотид, который представляет собой
человеческий полинуклеотид; или
(ii) интересующий полинуклеотид, содержащий область локуса Т-клеточного альфа-рецептора; и/или
(b) вторая полинуклеотидная вставка содержит:
(i) интересующий полинуклеотид, который представляет собой человеческий полинуклеотид;
(ii) интересующий полинуклеотид, содержащий область локуса Т-клеточного альфа-рецептора.
36. Способ по пп. 35, в котором первая или вторая полинуклеотидная вставка содержит интересующий полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один генный сегмент вариабельной области и/или генный сегмент соединительной области локуса Т-клеточного альфа-рецептора.
37. Способ по п. 35 или 36, в котором область локуса Т-клеточного альфа-рецептора получена от человека.
38. Способ по любому из пп. 1-35, в котором первая полинуклеотидная вставка содержит интересующий полинуклеотид, содержащий нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина.
39. Способ по любому из пп. 1-38, в котором этап идентификации выполняют посредством анализа определения модификации аллеля (МОА).
40. Способ по любому из пп. 6-35, в котором:
(а) первая полинуклеотидная вставка содержит:
(i) интересующий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательности в геноме клетки;
(ii) интересующий полинуклеотид, содержащий экзогенную нуклеотидную последовательность; или
(b) вторая полинуклеотидная вставка содержит:
(i) нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательности в геноме клетки; или
(ii) интересующий полинуклеотид, содержащий экзогенную нуклеотидную последовательность.
Наверх