Способ специфической идентификации последовательностей днк - заявка 2017102365 на патент на изобретение в РФ

1. Способ специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце, включающий следующие этапы:
а) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), для которой реакционная смесь включает
термостабильный фермент, обладающий 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью,
а также, для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК включает по меньшей мере
одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой
один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий
3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом в процессе ПЦР, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;
при этом в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
б) проведение плавления реакционной смеси в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, подразумевающее пошаговое изменение температуры реакционной смеси со считыванием флуоресцентного сигнала на каждом шаге, при этом сигнал при плавлении дуплекса генерируется за счет разобщения меток, имеющих перекрывающиеся спектры поглощения и испускания, входящих в состав отщепленного 5'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнального зонда, а нерасщепленный мишень-специфичный зонд образует недетектируемый дуплекс с сигнальным зондом, при плавлении которого сигнал не генерируется, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток с перекрывающимися спектрами поглощения и испускания; при этом дифференциация дуплексов, соответствующих идентифицируемым различающимся участкам последовательностей ДНК, осуществляется по двум параметрам - канал детекции и/или температура плавления;
при этом варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК выбирают из следующих двух вариантов:
1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывается со спектром поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
2. Способ по п. 1, в котором осуществляют определение от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в одном канале детекции амплификатора.
3. Способ по п. 2, в котором осуществляют определение от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в каждом канале детекции амплификатора.
4. Способ по п. 1, в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом от 0,01 до 1°С.
5. Способ по п. 1, в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом 0,5°С.
6. Способ по п. 1, в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют в диапазоне температур от 0°С до 100°С.
7. Способ по п. 8, в котором температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, ниже температуры плавления праймеров, входящих в реакционную смесь.
8. Способ по п. 1, в котором в качестве флуорофора или репортерного флуорофора используют по меньшей мере один из красителей карбоксифлуоресцеин (FAM), 6-карбоксиродамин (R6G), карбокси-Х-родамин (ROX), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (6-JOE), тиадикарбоцианин (Су5™).
9. Способ по п. 1, в котором в качестве гасителя флуоресценции используют гаситель флуоресценции серии BHQ и/или RTQ.
10. Способ по п. 1, в котором в качестве термостабильного фермента, обладающего 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, используют Taq ДНК полимеразу.
11. Способ по п. 1, в котором сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух различающихся последовательностей ДНК, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере
два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 3'-сегментов мишень-специфичных зондов,
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК.
13. Способ по любому из пп. 1-11, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере, двух различающихся последовательностей ДНК, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере
два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 3'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
14. Набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце способом по п. 1 путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий по меньшей мере
одну пару зондов, в которой
один представляет собой мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, имеющий
3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом в процессе ПЦР, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;
выполненных таким образом, что в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд, при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК, расщепляется термостабильным ферментом, обладающим 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизующеготся с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК выбирают из следующих двух вариантов:
1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
15. Набор по п. 14, включающий по меньшей мере одну пару зондов для выявления каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК.
16. Набор по п. 15, дополнительно включающий термостабильный фермент, обладающий 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, и для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК по меньшей мере одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК.
17. Набор по п. 16, в котором термостабильный фермент, обладающий 5'→3' ДНК полимеразной и 5'→3' экзонуклеазной активностью, представляет собой Taq ДНК полимеразу.
18. Набор по п. 14, предназначенный для определения от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в одном канале детекции амплификатора.
19. Набор по п. 18, предназначенный для определения от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в каждом канале детекции амплификатора.
20. Набор по п. 14, в котором флуорофор или репортерный флуорофор выбран из карбоксифлуоресцеина (FAM), 6-карбоксиродамина (R6G), карбокси-Х-родамина (ROX), тетраметилкарбоксиродамина (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеина (6-JOE), тиадикарбоцианина (Су5™).
21. Набор по п. 14, в котором гаситель флуоресценции выбран из гасителей серии BHQ и/или RTQ.
22. Набор по п. 21, в котором гаситель флуоресценции выбран из BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3.
23. Набор по п. 14, в котором, по меньшей мере для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, зонды выполнены таким образом, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, ниже температуры плавления праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК.
24. Набор по п. 14, в котором сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
25. Набор по любому из п.п. 14-23, включающий каждый из компонентов в необходимых для проведения анализа количествах.
26. Набор по п. 14, характеризующийся тем, что при плавлении реакционной смеси, получаемой в результате смешивания компонентов набора, в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса входящих в набор мишень-специфичного и сигнального зондов, без предварительного проведения ПЦР, указанные дуплексы не детектируются.
27. Набор по любому из п.п. 14-25, включающий по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых содержат одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, но различаются по температуре плавления так, чтобы обеспечить возможность осуществить дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по температуре плавления.
28. Набор по любому из п.п. 14-25, включающий по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры так, чтобы обеспечить возможность дифференциации различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по спектрам испускания флуорофоров, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда.
Наверх