Патенты автора Рябко Алена Константиновна (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus 1B9C7, продуцирующий человеческие моноклональные антитела, специфичные к домену ботулиническому токсину типа A (LC BoNT/A) Clostridium botulinum. Штамм депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур “ГКПМ-Оболенск”, коллекционный номер Н-96. Изобретение расширяет арсенал средств для получения моноклональных антител, способных нейтрализовать протеолитическую активность LC BoNT/A, что может быть использовано для последующего изготовления терапевтического препарата. 5 ил., 5 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу амплификации нуклеиновых кислот тяжелой и легкой цепи человеческих иммуноглобулинов. Изобретение позволяет снижать вероятность ложноотрицательной амплификации, повышая вероятность успешной амплификации кДНК антител с редко встречающимися аллелями V генных сегментов. 16 ил., 6 пр.
Предложен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1E10, продуцент мышиного моноклонального антитела 1Е10, которое специфически связывается с протективным антигеном Bacillus anthracis в области IV домена. Указанный штамм депонирован в «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» под № Н-89. Предложено мышиное моноклональное антитело 1Е10, нейтрализующее летальный токсин Bacillus anthracis, специфически связывающееся с протективным антигеном Bacillus anthracis в области IV домена. Антитело 1Е10 характеризуется константой равновесной диссоциации 9,1564×10-10 М и представлено двумя идентичными тяжелыми и двумя идентичными легкими цепями, образующими молекулу IgG1, с аминокислотными последовательностями легкой цепи SEQ ID NO: 1 и Fd фрагмента тяжелой цепи SEQ ID NO: 2. Также предложено химерное рекомбинантное моноклональное антитело xi1E10, нейтрализующее летальный токсин Bacillus anthracis, полученное путем замены константных доменов легкой цепи и тяжелой цепи вышеуказанного антитела 1Е10 на аналогичные области иммуноглобулина G1 человека, экспрессируемое в эукариотических клетках линии ExpiCHO-S, специфически связывающееся с протективным антигеном Bacillus anthracis в области IV домена. Антитело xi1E1 характеризуется константой равновесной диссоциации 1,2663×10-9 М и представлено двумя идентичными тяжелыми и двумя идентичными легкими цепями с аминокислотными последовательностями легкой цепи SEQ ID NO: 3 и тяжелой цепи SEQ ID NO: 4. Группа изобретений обеспечивает получение антител с высокоаффинным и высокоспецифичным связыванием с протективным антигеном Bacillus anthracis в области IV домена, имеющим нейтрализующее действие в отношении летального токсина Bacillus anthracis. 3 н.п. ф-лы, 15 ил., 11 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой последовательность ДНК-аптамера, связывающуюся с пептидогликан-ассоциированным липопротеином Legionella pneumophila, представляющую собой последовательность одноцепочечного ДНК-аптамера AptPAL_23 длиной 81 нуклеотид, с молекулярной массой 28 кДа, с первичной последовательностью CATACGTTCGACTGCTACGTGCATTCTTCTCCTGGGGGGGCTGCCGTCTCTACAGGGCATTATGTGAGATGTACAGACTAG, содержащую области для связывания с праймерами длиной 18 нуклеотидов в крайних положениях последовательности, формирующую трехмерную структуру, образующую устойчивые специфичные связи с ПАЛ Legionella, имеющую константу равновесной диссоциации (KD) в отношении ПАЛ не менее 5×10-8 М. Изобретение позволяет детектировать легионеллезный антиген ПАЛ в составе тест-систем в качестве специфической амплифицируемой матрицы. 8 ил., 6 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL – продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila. Гибридная клеточная линия 1F11PAL получена путем гибридизации мышиной миеломной линии Sp2/0-Ag14 со спленоцитами гипериммунных в отношении PAL мышей линии BALB/c депонирована в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Н-78. Изобретение обеспечивает специфическую детекцию бактерий Legionella pneumophila и может быть использовано в лабораторных биологических и медицинских исследованиях, для получения и производства диагностических тест-систем, способных идентифицировать возбудителей легионеллезов. 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-Ba-LF, продуцирующий человеческие моноклональные антитела против летального фактора возбудителя сибирской язвы. Штамм депонирован в “ГКПМ-Оболенск”, коллекционный номер Н-79. Продуцируемые антитела способны к нейтрализации летального токсина Bacillus anthracis на клеточной модели in vitro и in vivo при введении лабораторным мышам летального токсина Bacillus anthracis, составленного из рекомбинантных белков протективного антигена и летального фактора, с предшествующей ему пассивной иммунизацией животных заявленными антителами. Введение антител увеличивает выживаемость животных при проведении пассивной иммунизации. Использование изобретения обеспечивает получение моноклональных антител, способных нейтрализовать летальный токсин возбудителя сибирской язвы, что может найти применение далее в качестве пассивной защиты человека при заражении или потенциальном заражении сибирской язвой. 6 ил., 7 пр.
Предложен способ получения рекомбинантного экзопротеина А P. aeruginosa (rEPA). Способ включает получение экспрессионного плазмидного вектора pET-rEPA (SEQ NO: 3), содержащего промоторную последовательность ДНК бактериофага Т7 и последовательности ДНК, кодирующие N-концевую область белкового продукта энхансера трансляции (аминокислотная последовательность MASMT), шесть остатков гистидина, сайт расщепления протеазой SUMO и оптимизированную для трансляции в Е. coli последовательность (SEQ NO: 1), кодирующую рекомбинантный белок rEPA (SEQ NO: 2). Осуществляют продукцию рекомбинантного химерного белка-предшественника в гетерологичной системе экспрессии в электрокомпетентных клетках Е. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидным вектором pET-rEPA с получением штамма Е. coli BL-rEPA, при 37°С для обеспечения накопления максимального количества белка-предшественника в растворимой фракции. Проводят лизис бактериальной массы в присутствии 4% Triton Х-100 для сохранения белка-предшественника в растворимой форме. Выделяют белок предшественник с помощью металл-хелатной хроматографии на сорбенте Talon, заряженном ионами Со2+, с последующим отщеплением гексагистидина и пептида SUMO протеазой SUMO из состава полипептида. Отщепленный рекомбинантный белок rEPA доочищают анионообменной хроматографией на сорбенте DEAE-Sepharose и гель-фильтрационной хроматографией на колонке, заполненной Superdex 200, с переводом в конечный буфер со значением рН 7.5, с получением рекомбинантного белка rEPA. Изобретение обеспечивает получение белка с высоким выходом, составляющим 0,25 г с литра бактериальной культуры. 4 ил., 4 пр.
Настоящее изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения слитого химерного рекомбинантного белка fliC:pagN. Для осуществления способа конструируют рекомбинантную плазмиду pETfliCpagN, затем трансформируют клетки Escherichia coli BL21(DE3) указанной плазмидой и культивируют полученный штамм BL-fliCpagN при температуре 37°С. Затем получают периплазматическую фракцию бактерий-продуцентов обработкой клеток лизоцимом в 20% растворе сахарозы с последующим центрифугированием, проводят очистку химерного белка fliC:pagN металл-хелатной, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографией с получением гомогенного конечного препарата белка fliC:pagN. Рекомбинантная плазмида pETfliCpagN содержит промотор бактериофага Т7 и несёт последовательности, кодирующие белки fliC, включая лидерную последовательность данного белка, и pagN S.typhimurium, объединенные короткой линкерной последовательностью GSVDSSSGGN, и слитые на 3'-конце с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов. Заявленный способ получения fliC:pagN позволяет синтезировать данный белок в растворимой форме с нативной N-концевой аминокислотной последовательностью, а также с выходом не менее 0,3 г белка с литра бактериальной культуры, обладающего 98% чистоты. 7 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа направленного истощения олигонуклеотидных библиотек в отношении водорастворимых белковых мишеней глутатион-S-трансферазы и стрептавидина. Представленный способ включает подготовку комбинаторной олигонуклеотидной библиотеки в количестве 1015 молекул к отбору, разведение олигонуклеотидов библиотеки до концентрации 1015 молекул на 1 мл, денатурацию олигонуклеотидов при 90°С в течение 10 минут и отжиг олигонуклеотидов при 37°С. Связывание глутатион-S-трансферазы или стрептавидина в количестве 1 мг с подготовленным пулом исходной олигонуклеотидной библиотеки в буферном растворе, содержащем 20 мМ Tris-HCl рН 7,4, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, и разделение полученной смеси нуклеиновая кислота/белок-мишень гель-фильтрационной хроматографией на фракции. Изобретение позволяет элиминировать из пула олигонуклеотидов максимально возможное количество аффинных к заданной мишени молекул, а повторение раундов такой селекции гарантирует отсутствие в финальном пуле молекул олигонуклеотидов, имеющих значимую для дальнейшего применения аффинность к мишени. Изобретение может быть применено для получения выскоаффинных аптамеров, применимых в области биомедицины. 7 ил., 7 пр.
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантной фосфатазы бактериальных липополисахаридов. Данный способ включает синтез оптимизированной для трансляции в E. coli последовательности ДНК, кодирующей белок фосфатазы LpxE F. novicida. Указанная последовательность ДНК представлена на Фиг.1А. Настоящий способ предусматривает последующее конструирование экспрессионного вектора, кодирующего химерный белок-предшественник с N-концевой химеризацией. Указанный белок-предшественник состоит из последовательности мальтоза-связывающего белка, сайта узнавания протеазой фактором Xa, шести гистидинов и фосфатазы LpxE F. novicida. Способ также предполагает получение рекомбинантного белка-предшественника продукцией в E. coli и его выделение и очистку. Указанный способ предусматривает последующее выщепление мальтоза-связывающего белка из состава полипептида и доочистку белка фосфатазы LpxE. Настоящее изобретение позволяет получать рекомбинантную фосфатазу LpxE F. novicida с высоким выходом. 6 ил., 5 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамера, которая связывается с протеолитической субъединицей нейротоксина типа A Clostridium botulinum. Данная последовательность ДНК-аптамера состоит из одноцепочечной ДНК длиной 81 нуклеотид, выбранной из группы: APT/LCBONTA N10, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACCCTCCACTTTTGACGGCTTCCTCGGGATTATACGGCTA ACCGAGGGTGAGATGTACAGACTAG, или APT/LCBONTA N16, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACTCTGCTGGGATGGCCTAGCAGCCGATTATTGG GCTAAGCGGGCGTGTGAGATGTACAGACTAG. Данная последовательность ДНК-аптамера обладает высокой специфичностью в отношении протеолитической субъединицы (легкой цепи) токсина типа A Clostridium botulinum с константами аффинности соответственно 1,2·109 М-1, 1,3·109 М-1. Изобретение позволяет ингибировать протеолитическую активность легкой цепи BoNT/A с высокой эффективностью. 10 ил., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия в биологических жидкостях, окружающей среде и продуктах питания бактерий Escherichia coli штамма O157:Н7, включающий дезинтеграцию бактерий ферментативной обработкой и лизис неионным детергентом, адсорбцию на парамагнитных частицах при помощи специфического моноклонального антитела, детекцию антигена бактерий Е.coli O157:Н7 при помощи специфического биотинилированного моноклонального антитела, связывание полученного комплекса с нековалентным коньюгатом ДНК-матрицы с нейтравидином, диссоциацию твердофазного комплекса "антитело-антиген Е.coli O157:Н7 - биотинилированное антитело-коньюгат" добавлением раствора глицин - HCl рН 2.6, ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы и выявление наличия бактерий Е.coli O157:Н7 по скорости нарастания флуоресцентного сигнала. Данный способ отличается высокой специфичностью и чувствительностью детекции и может быть использован в ранней диагностике геморрагического колита и санитарно-гигиеническом контроле над наличием его возбудителя. 5 ил., 8 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамеров. Указанный ДНК-аптамер связывается с шига-токсином типа 2 и представляет собой одноцепочечную ДНК AptStx2B17 длиной 81 нуклеотид и молекулярной массой 27 кДа. ДНК-аптамер специфически связывает В-субъединицу шига-подобного токсина 2 с константой связывания 1,7·109 М-1 и первичной последовательностью CATACGTTCGACTGCTACCTTAGCCTGGTCTTATGATGCCTGTTTGATCCTGATGGCTAATATGTGAGATGTACAGACTAG. Последовательность ДНК-аптамера отобрана в результате раундов позитивной селекции в отношении рекомбинантного белка В-субъединицы шига-токсина типа 2 на основе системы магносепарации с отделением белка-мишени, аффинно связанного со специфичными аптамерами, из состава химерного полипептида посредством расщепления химерного конструкта по сайту, содержащему субстрат протеазы летального фактора. ДНК-аптамер способен специфически детектировать В-субъединицу шига-подобного токсина 2 по методу ПЦР в режиме реального времени в концентрации до 10-11 г и нейтрализовать его активность по отношению к клеткам перевиваемой линии Vero в концентрации ID50=3 мкМ. Изобретение позволяет с высокой эффективностью детектировать В-субъединицу шига-токсина. 4 ил., 7 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК, которую используют в качестве зонда для обеспечения максимального соотношения «сигнал/фон» в тест-системах на основе иммуно-ПЦР. Указанная последовательность ДНК имеет длину 81 нуклеотид и представляет собой последовательность CA-TAC-GTT-CGA-CTG-CTA-CTG-GTG-CAA-CGG-GTT-CGA-TCA-GCT-CCG-CCG-GGC-CTC-CCA-ATC-CCC-CGT-GAG-ATG-TAC-AGA-CTA-G и CA-TAC-GTT-CGA-CTG-CTA-CCG-AAT-GGA-TGT-GTC-CGA-GCT-CCA-TTT-CCG-TCC-AAT-CCT-CTT-CGT-CGT-GAG-ATG-TAC-AGA-CTA-G. Данная последовательность ДНК инертна по связыванию с бычьим сывороточным альбумином и α-казеином, являющимися наиболее часто используемыми инертными белками в составе блокирующих растворов, применяемых в иммуноанализе, несет молекулу биотина в крайнем 5'- положении для образования комплекса с биотинилированным детектирующим антителом посредством одновременного взаимодействия с белком авидинового ряда. Предложенное изобретение обеспечивает высокое отношение «сигнал/фон» при детекции белка-мишени по методу иммуно-ПЦР. 8 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для отбора аффинных молекул. Конструируют плазмидную ДНК pGST/APT/X длиной 6193 п. н., массой 4,09 МДа, содержащую в качестве генетического маркера ген β-лактамазы и уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: BgIII 665 п. н., BamHI 779 п. н., XhoI 801 п. н. Плазмида pGST/APT/X состоит из NdeI-XhoI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+) и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, встроенной по сайтам NdeI-XhoI и объединяющей в своем составе последовательности, кодирующие фрагмент гена глутатион-S-трансферазы, пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, пептид GGLNDIFEAQKIEWHED, биотинилирующийся in vivo под действием биотин-лигазы E.coli, и линкерную последовательность, заменяемую с помощью генно-инженерных манипуляций по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI на последовательность, кодирующую белок-мишень В-субъединицу шига-токсина I. Изобретение позволяет проводить отбор высокоспецифических аптамеров к данному белку-мишени. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения наличия ботулинического нейротоксина типа А (BoNT/A). На парамагнитных частицах, несущих иммобилизованный белок G бактерий семейства Streptococcus, с блокированными раствором Денхардт-ДНК адсорбируют белок BoNT/A при помощи специфических высокоаффинных поликлональных антител. Детектируют образование комплекса белка BoNT/A с биотинилированным антителом посредством нековалентного коньюгата фрагментов ДНК с нейтравидином. Проводят ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени. Регистрацию присутствия BoNT/A в исследуемых образцах проводят по изменению уровня флуоресценции против контрольных. Изобретение обеспечивает эффективный способ определения наличия BoNT/A в пробах биологических жидкостей и тканей при первичной и вторичной интоксикации, а также в продуктах питания и может быть использовано для анализа как инфекционно опасных, так и инактивированных образцов. 5 ил., 1 табл., 5 пр.
