Патенты автора Олейников Игорь Павлович (RU)

Способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени // 2792156

Данное изобретение относится к микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой, планировании противоэпидемических мероприятий и исследований, связанных с изучением особенностей биологии возбудителя. Описан способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, проведение ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации. Амплификацию исследуемой ДНК проводят одновременно с пятью парами праймеров, при этом в инкубационную смесь вносят 0,5 мкл интеркалирующего красителя 50Х SYBR Green I для выявления продуктов амплификации по динамике изменения показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора. Учет результатов осуществляют по геометрическому методу, путем регистрации Дельта Ср, отраженному на экране монитора, а именно: при наличии целевого продукта генов ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3 формируется амплификон с низким показателем Ср, в пределах (8-15) циклов, подтверждая присутствие тестируемого гена типичных O1 и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 El Tor, в случае отсутствия специфической мишени реакция с парами праймеров образует амплификон с более высоким показателем Ср, в пределах (21-29) циклов, подтверждая отсутствие тестируемого гена. Технический результат заключается в создании простого быстрого и достоверного способа молекулярного типирования штаммов с помощью ПЦР с последующим электрофоретическим учетом результатов типичных и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae El Tor. 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНА ХОЛОДОВОГО ШОКА CSH1 У ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ // 2783023

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae с помощью ПЦР, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфическими праймерами CSh 1 и CSh с последующим учетом реакции амплификации. При этом в инкубационную смесь вносят 0,5 мкл интеркалирующего красителя SYBR Green I для выявления продуктов амплификации с последующим плавлением образовавшихся ампликонов, а по их температуре плавления, в диапазоне 72-94°С и по динамике изменения показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора, проводят учет результатов по геометрическому методу путем регистрации показателя Ср. При наличии целевого продукта - гена холодового шока cshl - формируется амплификон с низким Ср, а при отсутствии специфической мишени реакция с парой праймеров CSh 1- CSh 2 образует другие амплификоны с высоким Ср. Изобретение позволяет использовать его в лабораторной диагностике при проведении мониторинга холеры и проведении исследований, связанных с изучением особенностей биологии возбудителя, включающего идентификацию генетических структур, обеспечивающих адаптацию холеры к неблагоприятным факторам внешней среды. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ 01 VIBRIO CHOLERAE "ПОСТГАИТЯНСКОЙ" ЛИНИИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ // 2766192

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии. Сущность изобретения заключается в том, что в способе выявления токсигенных штаммов 01 Vibrio cholerae «постгаитянской» линии методом ПЦР в режиме реального времени проводят две реакции амплификации с помощью сконструированных двух пар праймеров: при этом в инкубационные смеси добавляют 0,5 мкл интеркалирующего красителя 5OX SYBR Green I. Учет результатов проводят по геометрическому методу путем регистрации Дельта Ср, отраженному на экране монитора, если разница между результатами амплификации первой пары праймеров Rtx01-Rtx02 и второй пары Rtx03-Rtx04 превышает 8 единиц циклов, то делают вывод, что клетка исследуемого штамма содержит ген rtx А4а с делецией 60 п.н., поэтому ее относят к штаммам «постгаитянской» линии токсигенных штаммов 01 Vibrio cholerae. В частном случае ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green 1, 1,0 мкМ каждого из праймеров, 5 мкл ДНК - ДНК матрицы, оставшийся объем - вода. Кроме того, в частном случае ПЦР реакции проводят с соблюдением режимов: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с. Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике для быстрого определения эпидемического потенциала каждого свежевыделенного штамма, включающего в себя выявление полного спектра уникальных генетических маркеров, позволяющих установить происхождение конкретного возбудителя. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ выявления токсигенных штаммов О1 Vibrio cholerae "гаитянской" группы методом ПЦР в режиме реального времени по конечной точке // 2729218

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при выявлении токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae "гаитянской" группы. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что амплификацию исследуемой ДНК проводят с помощью сконструированных праймеров: в присутствии двух олигонуклеотидных зондов: при этом анализ продуктов амплификации по конечной точке проводят в ПЦР детекторе, размещают пробирки в соответствующие гнезда, учитывают результаты амплификации визуально на мониторе компьютера по данным каналов FAM и HEX, где отражен уровень флюоресценции свечения, причем по каналу FAM в качестве фона (внутренний контроль) выбран ДНК штамма O1 Vibrio cholerae 19191 и положительный результат определяют по длине синей полосы, которая отражает уровень флюоресценции в опытных пробах, превышающий более чем в 2,5 раза длину полосы негативной (фоновой) пробы, подтверждая правильность выделения ДНК и отсутствие ингибиторов в пробах, а по каналу HEX в качестве негативного фонового контроля используют ДНК штаммов O1 Vibrio cholerae 5879 и результат считают положительным, если уровень флюоресценции исследуемой пробы зеленая полоса превышает фон (негативного контроля) более 2,5, то фиксируют в данной пробе токсигенный штамм "гаитянской" группы. При этом ПРЦ проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: праймеры 1055-1, 1095-2 и зонды 1095 ZW и 1095 ZH каждый по 1,0 мкМ, 1,5 мМ Mg - буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 0,25 ед. ДНК полимеразы, исследуемое ДНК - 25 нг, оставшийся объем - вода. Кроме того, ПЦР реакции проходят с соблюдением режимов: денатурация 95°С - 2 мин (1 цикл); 35 циклов: денатурация 95°С - 20 с; отжиг при 65°С - 20 с; синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 3 мин (1 цикл). 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

Способ дифференциации штаммов Legionella pneumophila путем молекулярно-генетического типирования // 2709174

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что из ДНК исследуемого штамма L. pneumophila выявляют четыре общих INDEL-гена, имеющих делеции определенного размера, а именно IND- А9Р84_02210, А9Р84_08285, А9Р84_03850 и А9Р84_07165, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля: к гену IND- А9Р84_02210 - праймеры TTCCCCTTATTTAAATGACACCA и AAGCATAATAGGCGGGAAGA, с длиной амплифицированного фрагмента 80 п.н. или 110 п.н., к гену IND- А9Р84_08285 - праймеры CAGAAGACAAAGCGGAATCTG и TGAGGCCGAGTTTCTTGACT, с длиной амплифицированного фрагмента 62 п.н. или 74 п.н., к гену IND- А9Р84 03850 - праймеры CAGGTATCTGCCACGAATCA и TGGTTGTTGTCCATTTGACTG, с длиной амплифицированного фрагмента 63 п.н. или 75 п.н., к гену IND- А9Р84_07165 - праймеры TGGGTATTAAGCAATACGCAAG и AACAGAAACACCATTTATGCTTTG, с длиной амплифицированного фрагмента 84 п.н. или 96 п.н., при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по четырем INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов L. pneumophila. Изобретение позволяет типировать штаммы возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов L. pneumophila, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил., 3 пр.

Способ молекулярно-генетического внутривидового типирования токсигенных штаммов Vibrio cholerae О1 Eltor // 2627193

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен способ молекулярно-генетического внутривидового типирования токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 Eltor. Способ включает выделение ДНК из исследуемого штамма Vibrio cholerae O1 Eltor, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет полученных результатов. Амплификацию исследуемой ДНК проводят сконструированными праймерами к каждому из ICE элементов индийского и мозамбикского типов, в присутствии интеркалирующего красителя Siber Green. Затем продукты амплификации подвергают плавлению, учет результатов проводят по температурным пикам плавления и размеру ампликона. При температуре плавления 87°С и размере ампликона 300 п.о. регистрируют наличие ICE индийского типа. При температуре плавления 79°С и размере ампликона 149 п.о. регистрируют наличие ICE мозамбикского типа. Изобретение позволяет быстро и достоверно определять происхождение выделенных токсигенных штаммов V. cholerae O1 Eltor. 1 ил., 4 табл., 3 пр.

Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica // 2612137

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Описан способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica, включающий стадии выделения ДНК микроорганизма из исследуемого материала и проведение с полученной ДНК двух реакций амплификации. При этом используется набор сконструированных специфических праймеров к вариабельным участкам области RD6 туляремийного микроба, где набор состоит из трех праймеров: RD6-com ATACTAGCTTCAATCTCTGTGG СТТТ RD6-hol ATGCACTGGTTGGAATACAAATC RD6-tul CACATAGCAAATTAGTTGGATATGGA и второй из двух праймеров: RD6-del1 AACAATACCAACACTATTGAGTAAAA RD6-del2 AGCCATGCAATTATTAAAGC. Подвид возбудителя туляремии определяют по размеру специфического амплификата, в случае первой реакции амплификации если он составляет 212 п.о., а во второй 85 п.о., то регистрируют Francisella tularensis subsp. holarctica, если соответственно 425-91 п.о., то Francisella tularensis subsp. tularensis и 419-85 п.о. определяют как Francisella tularensis subsp. mediasiatica. Изобретение расширяет арсенал средств для выявления трёх основных подвидов туляремийного микроба. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ВНУТРИВИДОВОГО ТИПИРОВАНИЯ V. cholerae О1 И О139 СЕРОГРУПП // 2575046

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен способ молекулярно-генетического внутривидового типирования Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп. Способ включает выделение ДНК из исследуемого штамма V. cholerae серогруппы O1 или O139, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции путем электрофореза. Амплификацию исследуемой ДНК проводят сконструированными специфическими праймерами к каждому из шести INDEL-генов, а именно к генам ompU, 1606, eamA, 096, CoA и cheA, каждый из которых имеет по две дискриминируемых аллели. Учет результатов типирования проводят как визуальную идентификацию после электрофореза, причем для каждого исследуемого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по двум или большему числу INDEL-генов. Путем сравнения выявленных INDEL-генотипов устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов V.cholerae O1 и O139 серогрупп. Изобретение позволяет выявлять уникальные генетические маркеры штаммов V.cholerae серогрупп O1 и O139, что может быть использовано в практике работы специализированных учреждений, занимающихся мониторингом за холерой. 1 ил., 4 табл., 3 пр.