Декапептид, обладающий липотропной активностью

 

Декапептид форму/ш iH-u-Tsr-u-ige-u-Piro-v-Uss-i.-Geu-ti-Gien-Vi-x-vs-u-T r-u-ser-u-Phe он обладающий липотропной активность. i

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИД=ТЕЛЬСТВУ (фей

1 иий

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3389030/23-04 (22) 26.11.81 (46) 15.04-.83. Бюл. и" 14 (72) Ю.А. Панков, Ю.М. Кеда, Ю.И. Щвачкин и М. Н. Рябцев (71) Институт экспериментальной экдокринологии и химии гормонов

АМН СССР (53) 547.964.4.07(088.8) (56) 1. Кеда Ю.М., Синицына А.Л, Осипова Т.А., Панков Ю.А. Характеристика жиромобилизующего пептида, выделенного из пепсиновых гидролизатов гормона роста человека.

"Биохимия", 1973, 38, P 4,659.

2, Юдаев Н,А., Швачки Ю.И., Рябцев М.Н.,Чукашев С.Г., Панков Ю.А.

Кеда Ю.М. Синтез и свойства тетра- . декапептида, выделенного из пепсиновых гидролизатов гормона роста человека и обладающего высокой жиромобилизующей активностыа.

"Биорганическая химия", 1976, 1, и 10; 1531..,Я0„„1011632, А

ggy С 07 С 103/52; А 61 К 37/02 (54) ДЕКАПЕПТИД, ОБЛАДАКМЦИЙ ЛИПОТРОПНОЙ АКТИВНОСТ69(57) Декапептид формулы ! .И-Ол.-Iree-I;Pve-Ü-Ü -1.-Geo -жа-1 -М -1 -Ън -1.-Ser-l;the ON, обладающий липотропной активностье.

1011632

Изобретение относится к новому биологически активному соединениюдекапептиду, обладающему липотропной активностью, которое может найти.применение в медицине в качестве жиромобилиэующего препарата.

Известно, что соматотропный гормон обладает липолитической активностью $1).

Известен тетрадекапептид последо1О вательности 31-44 :оматотропного гормона человека формулы

, 15

HLPSe-L-á8 u-L-Мо-Ь-АЕс-Ь-ТУ "-1.-ЭМ-, -L -Pro -L-Ьзв-1.-QCu-L-Юи-L-Ь Ь-4-Тм

-Ь-"Ье)--4-РИеой обладающий высокой липотропной активностью ? ).

Недостатками указанного тетрадека- 20 пептида являются сложная структура (14.аминокислотных остатков) и многостадийный синтез.

Цель изобретения - расширение арсенала средств, влияющих на жировой 25 обмен в тканях животных.

Поставленная цель достигается согласно изобретению декапептидом формулы

ИПЭг- L-МЕ-L-Рr o-L-1. S-L- Юо-1-Ыи30

-Ь -Lsq-1.-l r — L-Ser- L-РйеОИ обладающим липотропной активностью.

Предлагаемый декапептид получают твердофаэным методом синтеза с 35 использованием в качестве полимерного носителя хлорметилированного сополимера стирола с дивинилбензолом путем ступенчатого наращивания пептидной цепи. л

На чертеже представлена схема синтеза декапептида.

Принятые сокращения: (Р) - полимерный носитель, Вос - трет-бутилокс ика рбонил, 2 -бенэилоксика рбонил, RZg — бензил, 01 р — и-нитрофениловый эфир. В синтезе использованы следующие производные 4-аминокислот {фирма "Реанал" ВНР): трет-бутилоксикарбонил (БОК)-фенилаланин N-БОК-О-бен1

50 зил-серин, N-БОК-О-бензил-тирозин, й"-b0K-N -карбобензоксилизин, и-нитрофениловый эфир М-БОК--лутамина, 2J - бенэиловый эфир М-БОК-глутаминовой кислоты; N-БОК-пролин и Й-БОК-изолейцин.

8 качестве нерастворимого носителя при синтезе декапептида использован сферический хлорметилированный сополимер стирола с ?4 дивинилбензола (содержание хлора 2 ммоль/г полимера) .

Реакции конденсации проводят с применением в качестве конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДЦПГ); единственное исключениеприсоединение остатка глутамина, который в пептидную цепь вводят методом и-нитрофениловых эфиров.

Снятие пептида с полимерного носителя и его исчерпывающее деблокирование проводят действием бромистого водорода в трифторуксусной кислоте в присутствии анизола, Сырой продукт после снятия с полимера-носителя переосаждают из метанола эфиром, хроматографируют на колонке с целлюлозой в среде н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12:10:3) и лиофилизируют. Чистоту полученного препарата контролируют бумажной хроматографией (БХ) на ватмане ММ У 3 и тонкослойной хроматографией (ТСХ) на пластинках "Силуфол" (ЧССР) в системах н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12:

:10:3) (система А), этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода (5:5:1:3) (система Б), иэоамиловый спирт-пиридин-вода-уксусная кислота (7:8:6 .2) (система В), а также определением

М-концевых аминокислот по методу Эдмана и аминокислотным и элементым анализами °

Основные этапы синтеза декапептида 1 следующие: присоединение С-концевой аминокислоты к полимеру-носителю; наращивание полипептидной цепи на полимере; отделение декапептида от полимера-носителя с одновременным удалением защитных групп; очистка дека.пептида с последующей характеристикой его физико-химических и липотропных свойств.

Присоединение С-концевой аминокислоты к полимеру-носителю.

Перемешивают в течение 18 ч при кипячении смесь 4,3 г (16 ммоль)

БОК-фенилаланина, 8 г полимера-носителя и 2,016 мл (13,4 ммоль) триэтиламина в 45 мл этилацетата. Далее реакционную смесь охлаждают до 20 С, полимер отфильтровывают, последовательно промывают этилацетатом, этанолом, водой, этанолом, диоксаном, обрабатывают 4,7 н. раствором хлористого ,водорода в диоксане, промывают диоксаном и эфиром и сушат в вакууме

10116

32 4

3 над Р О <. Для определения количества аминокислоты на полимере 18 мг полученного феййлаланил-полимера подвергают гидролизу при 1300С в течение 5 ч в смеси 12 í. HCt и пропионовой кислоты (no 2 мл) и фильтруют.

По данным аминокислотного анализа фильтрата после его упаривания коли" чества БОК-фенилаланина на полимереносителе составляет 0,98 ммоль/г. 1ю

Наращивание полипептидной цепи на полимерном носителе.

Для построения полипептидной цепи на полимере БОК-фенилаланин-полимер (6,37 г; содержание аминокисло- 1 ты 6,27 ммоль) последовательно подвергают девять раз следующему циклу .обработок соответствующими растворителями и реагентами (количество растворителей при каждой обработке

60 мл): а) промывка диоксаном, 2 х 3 мин, б) обработка 4,7 н. хлористым водородом в диоксане 1 х 30 мин; .a) промывка диоксаном, 3 х 3 мин;

:г) .промывка хлористым метиленом, 2 х 3 мин; д) обработка 104-ным раствором триэтиламина в хлористом метилене, 1 х 10 мин; е) промывка хлористым метиленом, 4 х 3 мин; ж) добавление 18 ммоль соответствующей

БОК-аминокислоты, начиная с М-БОК-О-бензил-серина, в хлористом метилене; з) внесение в реакционную смесь

9 ммоль ДЦГК (начало конденсации); и) через 30 мин добавление еще 9 ммоль

ДЦГК; к} через 60 мин промывка хлористым метиленом» 3 х 3 мин (оконча. ние конденсации); обработка смесью

2 мп уксусного ангидрида и 1 мл .три этиламина в хлористом метилене дпя

I блокирования возможных свободных ами- 4 ногрупп, не вступивших в реакцию конденсации, 1 х 30 мин (далее цикл повторяется с новой БОК-аминокислотой), При введении в пептидную цепь остатка глутамина методом и-нитрофениловых эфиров (продолжительность конденсации 18 ч) на стадии 6 вместо хлористого метилена используют диметилформамид конденсацию также ве- 50 дут в диметилформамиде, а стадии з) и и) исключают.

Отделение декайептида от полимера-носителя с одновременным -удалением защитных групп.

Барботируют в течение 90 мин бро-,. мистый водород через суспензию 2 г защищенного декапептид-полимера в

20 мл трифторуксусной кислоты, 20 мл хлористого метилена и 2 мл анизола.

Затем полимер отделяют фильтрацией, промывают трифторуксусной кислотой (2 х 10 ыл)» и объединенные фильтраты упаривают при 25оС Остаток растворяют в смеси 20 мл метанола и 5 мл диметилформамида и переосаждают добавлением 45 мл эфира. Осадок отделяют центрифугированием, промывают эфиром, снова центрифугируют и сушат.

Получают 1 г сырого продукта.

Очистка декапептида

0,308 г сырого продукта растворяют в 2 мл смеси н-бутанол-уксусная кислота-вода-пиридин (15:3:12:10), и раствор наносят на колонку (25 х 3 см), заполненную суспензией целлюлозы . (Fi1trak-VND) (ГДР) в той же смеси растворителей. Указанную смесь растворителей используют далее в процессе элюирования вещества с колонки. Разделение контролируют с помощью ТСХ на пластинках "Сипуфол" в системе А.

Фракции, содержащие основное вещество, объединяют и лиофилизируют. Полу" чают 0,171 r (выход 504 в расчете на

С-концевую аминокислоту) декапептида в виде белого твердого вещества с т.пл. 193-195 C (разп.),(oL)g=

= -73o» с = 0 37; 2 í. СН>СООМ .Ку=

= 0,50 (БХ в системе А), 0,41 (ТСХ в системе А), 0,51 (ТСХ в системе Б), 0,31 (ТСХ в системе В), Элементный анализ.

Найдено, 3: С 53,51; H 7 07»j

Й11,23

C Н йО„-5 СН СООН 2Н20

Вычйслено, Ж: С 58,51; Н 7,07;

11,11.

Аминокислотный анализ, 3: РЬе 1,07 (1,00);Se1- 1,00 (1,00); Tyr 1,63 (2,00); Lyq 1,84 (2»00); Pro 1,00 (1,00); Д te 0,90 (1,00); aiu 2»17 (2,00) .

Проводят биологические испыта. ния предлагаемого декапептида.

По окончании наращивания пептидной цепи полученный защищенный декапептид-полимер промывают этанолом, уксусной кислотой и эфиром и сушат в вакууме над Р» О .

Испытание имеет целью определить влияние синтетического декапептида, на скорость липолиза у кроликов

1п vivo и iè vitro и провести сравнение липотропного действия описыва" емого декапептида и известных соедиДоза, Увеличение мкг/мл концентраОпыт, Ф

Препарат ции НЖК за l20 мин инкубации, Ф

Опыт, Препарат

Доза, мкг/к

Увеличение Зр концентрации НЖК в плазме крови, 3

1 Декапептид

854> 6 физиологический раствор

44 93=18

3 10»6 нений - соматотропина человека ы .синтетического тетрадекапептида.

Изучение липотропного действия декапептида.

В опытах 1n vivo липотропную активность определяют по увеличению концентрации неэтерифицированных жирных кислот (НЖК) в плазме крови животных после введения им препаратов.

Кроликам (вес 2000-2500 г) после

24 ч голодания вводят внутримышечно препарат в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводят чистый Физиологический раствор.

Каждая группа животных состоит из 6 кроликов. Пробы крови отбирают из ушной вены до введения и через 30 мин после введения декапептида и тетрадекапептида или через 240 мин после введения соматотропина, так как его 20 липотропное действие требует длительного латентного периода. Уровень

НЖК в крови определяют по методу

Фолхолта °

Результаты влияния декапептида I 2S на скорость липолиза у кролика in

vivo приведены в табл.

Т "аблица 1

° 40

2 Декапептид I

3 Тетрадекапептид Х1 44 105 11

Соматотропин человека 66 4 1+7

Концентрацию НЖК в плазме крови определяют в опытах У 2 и 3 через 30 мин после введения препаратов, а в опыте Р 4 - че" рез 240 мин.

Липотропную активность in vitro оценивают по стимуляции липолиза в изолированной околопочечной жировой ткани кролика, инкубируемой в присутствии декапептида.

32 d

В опытах in vitro кусочки околопочечной жировой ткани кроликов весом 80 мкг измельчают ножницами и инкубируют в 2 мл бикарбонатного буфера Кребса-Рингера, содержащего 33 бычьего сывороточного альбумина, при 37 С.в атмосфере карбогена (953

О + 6Ф СОд ) в течение 120 мин.Опытная йконтрольная группы состоят из

5 кроликов. В опытные пробы добавляют по 0,1 мл Физиологического раствора, содержащего испытуемые дозы декапептида или тетрадекапептида, в контрольные пробы — по 0,1 мл физиологического раствора. Ilo окончании инкубации в 5 мкл инкубационной смеси определяют содержание НЖК по методу Фолхолта с помощью калибро-. вочной кривой, построенной по пальмитиновой кислоте.

Результаты влияния декапептида на скорость липолиза в жировой ткани кролика in vitro представлены в табл. 2.

Таблица 2

2 Тетрадекапептид 1f 5 89+12

Декапептид,тетрадекапептид исоматотропин в опытах in vivo увеличивают уровень НЖК в плазме крови кроликов соответственно на 93И83, 105-114 и 4È=73. Таким образом, в условиях

in vivo декапептид и тетрадекапептид обладают примерно равным эФФектом, значительно превышающим липотропное действие соматотропина.

Я опытах in vitro декапептид форму лы I и тетрадекапептид Формулы 11 также обладают примерно равным липотропным действием, увеличивая концентрацию HNK в инкубационной среде соответственно на 85-163 и 89Й 23

Предлагаемый декапептид формулы 1 обладает липотропной активностью, сопоставимой с активностью те1радекапептида, и значительно превосходит по активности СТГ. Однако в отличие, от известного тетрадекапептида пред7 1011632 8 лагаемый декапептид имеет более прос вотных) декапептид вводят одноразо= тое строение, так как является более во внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг коротким пептидом и содержит в сво- веса в 0,5 мл физиологического ем составе только 10 аминокислотных раствора. Животных забивают через остатков. сутки после введения препарата.РазПроводят испытания на токсичность .дражения, уплотнения ипи инфильтраописываемого декапептида. тов в местах введения препарата не

Токсичность декапептида исследу- обнаружено, изменения поведения и ют в острых опытах 1 "острая" токсич- состояния животных после введения ность) н* трех видах животных и в t0 препарата не наблюдается, токсичесхроническом опыте ("хроническая" ток- ких морфологических изменений в ор. сичность) на одном виде животных. ганах и тканях не выявлено.

Определение "острой" токсичности. Определение хронической токсич"

Острую токсичность декапептида :мости. проверяют на крысах, мышах и морских )s св ках

Испытание проводят на мышах-самцах !

При испытании на крысах-самцах

; весом 20-25 г (исхо ный

5 (д ый). К концу опыnwv В secov 110-120 r(10Kp c) та вес мышей возрастает до 26-35 г раз в течение 3 недель в общей дозе вводят одноразово внутрибрюшинно ,в дозе 20 мг/кг веса в 0,5 мл физио600 мг/кг веса тела о но азовая оза

;логического раствора. Указанная доза вают на следующий день после после -. но превышае

В укаэанной дозе препарат не оказы. вает.местного раздражающего действия и не изменяет внешнего состояния и шей в контрольной и опытной г ппах поведения животных. При забое животравно 10. Раз ажений плотнений ных через сутки после введения пре парата каких-либо уплотнений ин30 опытных животных в течение экспери" фильтратов в местах введения не выявлено Токсических изменении в ор мента не отличались от таковых У конт ганах и тканях не наблюдается. . P

При испытании на мышах-самцах чавших препарата. В Удаленных после З е ыявлено Данные ческих изменений не выявлено. дозе 50 мг/кг веса тела в 0 5 мл физиЬлогическо из логического раствора. Животных тканей мышей, получавших в течение

3 недель декапептид, представлены в табл. 1. препарата. Токсических измененийраздражения, уплотнений-,инфильтратов + В общей дозе, в 40 раэ превышающей в местах введения, изменения поведе- активную дозу препарата, при введе-. ния и состояния животных после вве- нии декапептида.не обнаружено статидения препарата, а также изменений стически достоверных различий: в весе в органах и тканях не обнаружено. различных органов и тканей животных, При испытаниях на морских свин-. 4S получивших декапептид, и контрольных ках-самках весом.180-200 г (10 жи- животных.

1011632

Щ

Р)

Р) Bz аиВ

Ва

Ва

° ЮВ Ф М вав

Вг

Составитель В. Волкова

Рецакто Л Повхан Техре@Т.Маточка !(ооректоо: В. Гирняк

Заказ "..679/29 . Тираж. Ц16 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Рачшская наб, и. 4/6 юю е в.вввАЬма Зев

Ю Въ ввв4 у

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.. Проектная, Й

-2 Э 4 5 б F . ь У f0

12е йю )Щи Ща 61 а. Aye. тую sat Ne

n}

У)

Р)

Щ

t)

Р) м)