Способ получения окрашенного субстрата для определения целлюлазной активности

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ OKPAUEH0ОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮ ЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ путем окрашивания карбоксиметилцеллюлозы активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, о л и чающийс я тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, повышения его выхода и упрощения процесса , окрашивание осуществляют красителем активным ярко-оранжевым ЖТ, взятым в количестве 20-200% от массы карбоксиметилцеллюлозы, а отделение несвязанного красителя осуществляют с помощью диафильтрации. 2. Способ по п. 1, отл.ичающ и и с я тем, что окрашивание осу (Л ществляется при 30-6О с. СП с: О ел ел

„„SU„„1056055 А

СО)ОЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

Щ1) 6 01 И 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H АВТОРСКОМУ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ! (21) 3463412/28-13 (22) 05.07.82 (46) 23,11.83. Бюл. Р 43 (72) P.È.Савицкене, В.Ю.Авижвнис, В.Б.Герасимас, Г.И.Денис, Ю.Ю.Степонавичюс, И.И.Кодулас, В.И.Лауцюс и Ю.Ю.Мачюлайтите (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной знзимологии .(53) 577,15.07 (088.8) (Ьб) 1. Huang Sung San Tang Jordan, Sensitive Assay for Cellulase апй

Dextranase.- Anal. Biocnem., 1976, ч. 73, Р 2 р ° 369-377 °

2. Nc C1eary В.V. Меч сйхотодеп1с

substrates for the assay of alpha—

amylase and (1 4)-р-Э-glucanase. СахЬ. Research, 1980, v, 86, р. 97-104. (54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКРАШЕННОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗНОЯ АКТИВНОСТИ путем скрашивания карбоксиметилцеллюлозы активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, повышения его выхода и упрощения процесса, окрашивание осуществляют красителем активным ярко-оранжевым ЖТ, взятым в количестве 20-200% от массы карбоксиметилцеллюлозы, а отделение несвязанного красителя осуществляют с помощью диафильтрации.

2. Способ по и. 1, о т л.и ч а ю- Е шийся тем, что окрашивание осуществляется при 30-60 С. о

1056055

Изобретение относится к энзимологии, микробиологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для определения целлюлаэной активности в ферментных препара- . 5 тах и в биологических средах.

Известен способ получения окрашенного субстрата для определения активности целлюлаэ, включающий активирование карбоксиметилцеллюлозы карбоди->0 имидом и связнвание ее с хромофорными веществами через нитрофенильные группы (1) .

Недостатками способа являются необходимость активации карбоксиметилцеллюлозы карбодиимидом перед добав. лением хромОфорйых веществ, а также наблюдаемое снижение активности цел« люлазы при взаимодействии с нитрофенильными группами.

Наиболее близким к предлагаемому 20 по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получе- ния окрашенного субстрата для определения целлюлаэной активности путем окраш1.вания карбоксиметилцеллюлоэы 25 активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, причем карбоксиметилцеллюлозу предварительно обрабатывают раст- 30 вором целлюлазы.для частичной депо-. лимериэации, отделение несвязанного красителя проводят с помощью многократного переосаждения этанолом, со держащим 0,02 N KC1, в качестве кра- 35 сителей используют ремазол ярко-чер; ный В или ремазол ярко-синий R npu соотношении краситель-карбоксиметилцеллюлоза 1:1 по весу. Процесс скрашивания обычно осуществляют при 40

60оС (2), Однако субстрат, получаемый таким способом, обладает узким прямолинейным интервалом зависимости оптической плотности от глубины превраще- 45 ния. Это сужает пределы определения ферментативной активности целлюлазных комплексов, что является недостатком качества получаемого продукта. Кроме того, карбоксиметилцеллю" лоза, окрашенная ремазолом ярко-чер" ным .В, образует в воде желеобраэные суспенэии, что приводит к искажению результатов определения активности.

Еще один недостаток известного спо" соба в том, что он трудоемок, Это связано с необходимостью частичной деполяризации исходной карбоксиметилцеллюлозы с помощью целлюлаэного комплекса с целью улучшения растворимости субстрата. 60

Кроме того,,многократное осаждение . Окрашенного продукта большим количеством этанола удаления не связанного ковалентно красителя снижает выход субстрата. 65

Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта, повышение его выхода и упрощение процесса, Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения окрашенного субстрата для определения целлюлазной активности, предусматривающим окрашивание карбоксиметилцеллюлозы активным краситеЛем с после" ду ющим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, причем окрашивание осуществляют красителем активным ярко« оранжевым ЖТ, взятым в количестве

20-200Ъ от массы карбоксиметилцеллюлозы, а отделение несвязанного красителя осуществляют с помощью диафильтрации, Окрашивание обычно осуществляют пр 30-60ОС.

Способ осуществляется следующим образом.

Связывание красителя с карбоксиметилцеллюлозой проводят в течение

1-2 ч при 30-60 С.Диафильтрацию про водят до получения оптической плот" ности диафильтрата при длине волны

490 нм не более 0,8 (для удаления ковалентно несвязанного красителя и солей из раствора окрашенного субстрата) с последующим осажцением полученногo.ïðoäóêòà этанолом. При, диафильтрации раствор окрашенного субстрата концентрируют, затем разбавляют концентрат дистиллированной ,водой до первоначального объема и опять подвергают диафильтрации. Таким образом, проводят несколько циклов диафильтрации окрашенного субст-. рата, пока не достигнут оптической плотности.диафильтрата при длине волны 490 нм не более 0,8, Установлено, что процесс диафильтрации окрашенного раствора карбоксиметилцеллюлозы подчиняется экспоненциальной функции. Для расчета необходимого количества воды для диализа пользуются следующей формулой:

Ч 2В+Ч Е.сус где V - необходимый объем воды для диализа окрашенного раствора карбоксиметилцеллюлозы1

V — исходный объем окрашенного о раствора карбоксиметилцеллюлозы после первоначального концентрирования;

С - оптическАя плотность фильт" рата после диафильтрации

Со — оптическая плотность (Dygp) исходного раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлоэы.

Пользуясь формулой (1), заранее определяют необходимый для диализа объем воды (при достижении в конечном диафипьтрате.D4gp не более 0,8).

1056055

Способ получения субстрата

Растворимость субстрата, мин

Выход субстрата, %

Интервал прямолинейной зависимости оптической плотности от глу" бины превращения субстрата

По примеру 1

По примеру 2

75

0 - О, 8

90 0 - 0,9

55 Π— Π5

Известный

Пример 1. 10 г карбоксиметилцвллюлозы растворяют в 1000 мл воды, перемешивая, приливают 1000 мл

0,2%-ного раствора красителя активного ярко-оранжевого ЖТ, В течение

60 мин небольшими порциями добавляют 20 г йп 50(, после чего приливают

100 мл 10%-ного растнора ЙпЗРО и перемешивают еще 60 мин ° Все операции проводят при 30еС. Полученный раствор охлаждают до комнатной темпера-. 0 туры и концентрируют диафильтрацией до конечного объема 0,5 л. Далее в диафильтрате определяют 0, з 44.

Согласно формуле (1), объем воды для диализа составляет 15

U 2, 84 - О, 5 1п44 =5, 7 л .08

После занершения процесса диафильтрации полученный концентрат (500 мл) осаждают 1000 мл зтанола в присутствии 0,01 М ЕС1. Выпавший осадок окрашенной карбоксимвтилцеллюло.Вы отделяют центрифугированием, промывают этанолом, эфиром и высушивают B вакуум-эксикаторе. Получают

7 5 г субстрата, имеющего вид оран" жевого порошка, хорошо растворимого и воде.

Пример 2. 20 г карбоксиметил- 3р целлюлозы .растворяют в 1000 мл ноды при 60оС, приливают 1000 мл 4%"ного

Растворимость определяют следую- 50 щим образом: 0,5 r субстрата заливают 50 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,0), смесь перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре и определяют время,. необходимое для полного растворения субстрата.

Из таблицы видно, что раствори.мость предлагаемого и известного субстратов лежит в интервале 15-20 мин иэ чего следует, что упрощение техно-е0 логии по предлагаемому способу не ухудшает растворимости субстрата. Выход субстрата по предлагаемому способу превышает его выход по известному способу на 20-35%. 65 раствора активного ярко-оранжевого

ЖТ, добавляют 40 г.Мс 5е, 200 мл

10%-ного раствора a,ÐÞ и перемешивают реакционную смесь -60 мин при 60 С.

Далев выделение субстрата проводят аналогично примеру 1. Получают

18,0 г субстрата в виде ярко-оранжевого пороШка.

Определения целлюлазной активности.

В две пробирки наливают по 1,0 мл

1%-ного растнора субстрата (полученно"

ro по примеру 2) н 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0 ° B одну пробирку .приливают .0,2 мл целлобронина Г10х с концентрацией 2,5 мг/мл, в другую0,2 мл буфера (контроль) и инкубируют при 40 С и течение 10 мин, после чего в каждую пробирку добавляют по 5 мл осадителя, содержащего

80%-ный монометнлоный эфир этиленгликоля, ацетатный буфер (0,3 М рН 5) и 0,4% ацетата цинка. Реакционную смесынз балтывают, выдерживают

0,5 мин и цейтрифугнруют 5 мин, после чего определяю оптическую плотнссть супернатанта при длине волны

490 нм против контрольной пробы.

Оптическая плотность 0,410.

Сравнительная оценка растворимости окрашенного субстрата, изготовленного по предлагаемому и известному ,способам дана н таблице.

На чертеже показана зависимость оптической плотности от глубины.превращения (нремени инкубации) предлага" емого субстрата.

Эту зависимость определяют по описанной методике,.используя целлюлазные комплексы Рапидаза и целло-. бронин Г10х по 0,04 ед. в каждой пробе (за единицу принимают актинность такого количества фермента, которое расщепляет 1 мк моль гликозндных связей за 1. мин.) .

Как видно из чертежа прямолинейный интервал зависимости оптической плотности от глубины превращения субстрата О. - 0,9 обеспечивает широкие пределы определения активности целлю1056055

Составитель В.Муронец

Редактор Н.Егорова Техред С.Мигунова Коррек тор М. Llapоши

Заказ 9292/36 Тираж 873 Подписное

ВПИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород„ ул.Проектная, 4 лаэ, что, в свою очередь, повышает точность определения. Таким образом, качество получаемого субстрата значи тельно лучше, чем известного.

Предлагаемюй способ получения окра-. шенного субстрата для определения " целлюпаэной активности упрощает технологию изготовления субстрата тем, что исключается предварительная обработка карбоксиметилцеллюлоэы целлюлазным комплексом. При этом раство- 10 римость окрашенного субстрата, изготовленного.по предлагаемому и известному способам, сходная.

Диафильтрация.через полупроницаемые мембраны раствора окрашенной кар-15 боксиметилцеллюлозы позволяет удалить ковалентно не связанные краси"

hens и соли и обеспечивает выход субстрата 75-90% (по известному способу выход продукта составляет 50-60%), Предлагаемый способ.диафильтрации позволяет исключить многократное переосаждение субстрата большими объемами этайола, тем самым упрощается технологический процесс nozjro-. товки субстрата и увеличивается безопасность процесса.

Предлагаемым способом получают субстраты, которые обеспечивают широкие пределы определения ферментативной активности комплексов, noc"" кольку обладают прямолинейным интервалом зависимости оптической плотности от глубины превращения субстрата (О -0,9), тогда как такой интервал для субстрата, изготавливаемого по известному способу составляет 0 - 0,5.