Способ получения флуоресцентного фосфатидилхолина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО -ФОСФАТИДИЛХОЛИНА с использованием природного фосфатидилхолина и антрацена, отличающийс я тем, что, с целью упрощения способа, природгелй фосфатидилхолин подвергают взаимодействию с антраценом в присутствии безводного хлористого алюминия при их мольнс соотношении , равном 1:1л 1-1,5:1,8-2,5, в среде безводного дихлорэтана при 1825 С .. сл

П9} (И}

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦ}4АЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (21) 3496065/23-04 (22) 29.09.82 (46) 23.01.84. Бюл. }} 3 (72) О. В. Богомолов, A. П. Каплун и В. И. Швец (71) Московский ордена Трудового

Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (53 ) 547. 26 118.07 (088. 8 ) (56) 1 ° Молотковский 10 Г. и др.

Синтез новых флуоресцентномеченых фосфатидилхолинов. - "Биоорганическая химия", 1979, 5, }} 4, с. 588594 °

2. Каплун A. П. и др. Синтез флуоресцентно-меченых фосфатидилхолинов с остатками 11- (2-антроил ) -ундекановой кислоты. — "Биоорганическая химия", 1978, 4, }} 11, с. 1567-1568 (прототип ) .

3. Bengham А. D. и др. Dif fusion

of .univalent Jon ecross lamela of

swolen phospholipids. — Journal

of molecular Biology, 1965, 13, 9 1, 238-252.

3(SD C 09 К 9/02} С 09 К 11 06 (54 ) (57 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО -ФОСФАТИДИЛХОЛИНА с использованием природного фосфатидилхолина и антрацена, о т л и ч а ю щ и й— с я тем. что, с целью упрощения способа, природ}ый фосфатидилхолин подвергают взаимодействию с антраценом в присутствии безводного хлористого алюминия при их мольном соотношении, равном 1:1 ."1,5:1,8-2,5, в среде безводного дихлорэтана при 1825оС

1068441

Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именно к новому способу получения флуоресцентного фосфатидилхолина, который может найти применение в качестве флуоресцентного зонда в молекулярной биологии и в медицине.

Известен способ получения флуоресцентного фосфатидилхолина, а именно 1-ацил-2 т (9-антроил ) -11-аминоундеканои+Бп-глицеро-3-фосфохолина, 10 который заключается в том, что 11-аминоундекановую кислоту метилируют абсолютным метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты, образующийся с количественным выхо- 15 дом метиловый эфир 11-аминоундекановой кислоты подвергают взаимодействию с хлорангидридом антрацен-9-карбоновой кислоты. Получающийся с .выходом 48%-ный метиловый эфир

N-(9-антроил )-11-аминоундекановой кислоты омыляют раствором гидроокиси натрия и образующуюся свободную

N-(9-антроил)-11-аминоундекановую ° кислоту (вы рд 79%) подвергают взаимодействию с лизофосфатидилхолином в присутствии тионилхлорида. Лизофосфатидилхолин получают ферментативным гидролизом фосфатидилхолина яичного желтка фосфолипазой А с выходом 80%.. 1-Ацил-2-ГN †(9-антроил )-11-аминоундеканоил -sn-глицеро-3-фосфохолин получается с выходом

30% в виде желтоватой воскообразной массы. Продукт имеет следующие характеристики: Rr 0,4 в системе хлороформ-метанол-вода (65:25;4); спектр флуоресценции (в этаноле,+ss

369 нм): смак<;, дг рс. 388, 407 и 430 нм C11 .

Недостатками укаэанного способа 40 являются многостадийность процесса, и использование дорогостоящего фермента фосфолипазы Аъ.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату 45 к предлагаемому является способ получения флуоресцентного фосфатидилхолина, а именно 1-ацил-2- (11-(2-антроил )-ундеканоил -sn-глицеро-3-фос; фохолина, основанный HB использовании природного фосфатидилхолина и антрацена. Однако природный фосфатидилхолин яичного желтка предваритель,но подвергают гидролиэу фосфолипазой

Аг с получением лиэофосфатидилхолина, а антрацен ацилируют смешанным ангид-55 ридом додекан-1,12-диовой и ортокремневой кислот,, образующимся непосредственно в реакционной массе при сме шении додекан-1,12-диовой кислоты с тетрахлоридом,кремния в нитробенэоле 60 в присутствии безводного хлористого алюминия, Далее образующуюся с выходом 41% 11-(2-антроил )-ундекановую кислоту подвергают взаимодействию с ,лизофосфатидилхолином в присутствии

N, N ойдо (имидаэол ) кетона в среде хлороформа.

1-Ацил-2- $11-(2-антроил)-ундеканоил)-sи-глицеро-3-фосфохолин выделяют препаративной тонкослойной хроматографией в виде желтоватой воскообразной массы с выходом 50%. Rf 0,4 в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4); УФ-спекгр/Д мдка, нм

Е//: 265 (1, 5 ° 10 ),,- 388 (1, 1 х х 10 ); спектр флуоресценции (в этаноле 26 5 нм ); Э-мма.ucnscк

455 нм.

Для использования полученного флуоресцентного фосфатидилхолина в качестве флуоресцентного зонда его необходимо смешивать с природным фосфатидилхолином в весовых соотношениях 1:10-200. Смесн, содержащая флуоресцентный и природный фосфатидилхолины в соотношении 1:10, имеет следующие характеристики: Rf 0,4 в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4); УФ-спектр „" ц* о /Е //

265/1500 ), 388 (110 ); спектр флуоресценции (в этаноле,3. возб. 265 нм

3макс. испуск. 455 нм 2 .

Недостатками известного способа являются многостадийность, использование дорогостоящего фермента фосфоли п азы Ag и дефицитного р еаге н та кар бо нилдииглидаэ ола.

Целью изобретения является упрощение способа получения флуоресцентно- го фосфатидилхолина.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения флуоресцентного фосфатидилхолина, заклю-, чающемуся в том, что природный фосфатидилхолин подвергают взаимодейст, вию с антраценом в присутствии хлористого алюминия при их мольном соотношении, равном 1,0:1,1-1,5:1,82,5, в среде безводного дихлорэтана при .1 8- 2 5 С.

Целевой продукт выделяют хромотографией в виде желтоватой воскообразной массы с выходом 78-80%.

При проведении процесса при температуре ниже 18 С реакция идет очень медленно. Повышение температуры выше 25 С приводит к некоторому уменьшению выхода целевого продукта вслед ствие большего образования нефлуоресцирующих продуктов, что осложняет очистку целевого продукта. Количество антрацена обусловлено тем, что при мольном соотношении фосфатидилхолин-антрацен, меньшем, чем 1:1,1, падает выход продукта реакции, а при мольном соотношении фосфатидилхолин: антрацен, большем, чем 1:1,5, увеличивается расход антрацена без увеличения выхода целевого продукта. При мольном соотношении фосфатидилхолин:. хлористый алюминий меньшем, чем 1."1,8 реакция не идет, а при соотношении большем, чем 1:2,5, резко возраста1068441 ет образование продуктов деструкции фосфатидилхоли на.

Получающийся продукт. имеет следующие характеристики: Rf 0,4 в системее хлороформ-мета нол- вода (6 5: 25:

4); УФ-спектр .) макс., нм (//

350 (196 ), 365 (177 ), 386 (137 ); спектр флуоресценции (в дихлорэтане, 3. возб. 365 нм); 3 макс. испуск.

420 нм; соотношение флуоресцентного и исходного фосфатидилхолина 1:10. 10 3 25 1: 3,5:2,5 79

Таким образом, для испоЛьзования предлагаемого флуоресцентного фосфа- 4 17 1:1,0:1,7 тидилхолина в качестве флуоресцентного зонда нужно брать природного фосфатидилхолина для разбавления в )5

10 раз меньше, чем в случае известного продукта.

Пример 1. 67,9 глг (0,085 ммоль ) фбсфатидилхолина ку.риного желтка и 16,6 мг (0,094 ммоль) 20 антрацена растворяют в 2,.5 мл безводного дихлорэтана и при перемешивании прибавляют 20, 4 мг (О, 153 ммоль ) безводного хлористого алюминия. Реакционную смесь перемешивают в течение двух часов при 18 С а затем разделяют с помощью препаратив ной тонкослойной хроматографии в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4). Получают 64,8 мг (78%) желтоватого воскообразного вещества, представляющего смесь флуоресцентного и исходного фоосфатидилхолинов (1:10).Rf 0,4 в системе хлороформметанол-вода (65:25:4); УФ-спектр (3. макс., нм // : 350 (196), 365 З5 (177), 386 (137); спектр флуоресценции (в,дихлорэтане, 3 возб. 365 нм

Д макс. испуск. 420 нм.

В таблице представлены примеры 40 получения флуоресцентного фосфатидилхолина при различных мольных соотношениях реагентов и температуре процесса (порядок смешения реагентов и условия выделения целевого продукта такие же, как в примере 1

1 18 1:1,1:1,8 78

2 20 1:1,3:2,2 80

5 26 1:1,6:2,6 . 66

Составитель M. Красновская

Редактор Г. Волкова ТехредM.Гергель Корректор М., Лароши

Заказ 11390/20

Тираж 638 . - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5.

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная, 4

В примерах 2-5 порядок смешения реагентов и условия выделения продух О тов реакции такие же, как и в приме- ре 1.

На примере модельной системы: липосомах из яичного фосфатидилхолина с N-стеароилтриптофаном и флуоресцент ным фосфатидилхолином (N-стеароилтриптофан использовали в качестве модели мембранного белка с поверхностной локализацией центра масс триптофанов) показано, что полученный предлагаемым способом флуоресцентный фосфатидилхолин может быть использован как акцептор энергии при исследовании различных липид-белковых комплексов методом фиксации индуктивнорезонансного переноса энергии. с ароматических аминокислот.

Липосоьы готовили по методу Бэнгхэма Г31: яичный .фосфатидилхолин-N-стеароилтриптофан (200:1); яичный фосфатидилхолин-флуоресцентный фосфатидилхолин (200:10); яичный фосфатидилхолин-N-стеароилтриптофан-флуоресцентный фосфатидилхолин(200:1: 10), Затем фиксировали спектры флуоре- сценции всех трех образцов,при

3. возб. 285 нм (на спектр спектрофлуориметре "Hitachi MPF-4", Япония, ширина щели 2 нм). При введении флуоресцентного фосфатидилхолина в липосомл, содержащие N-стеароилтриптофан, наблюдается уменьшение флуоресценции триптофана (350 нм) и увеличение флуоресценции фосфатидилхолина (412 нм).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения флуоресцентного фосфатидилхолина эа счет исключения дорогостоящего фермента фосфолипазы А2 ц проведения процесса в одну стадию.