Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител (его варианты)

 

1. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специЬических антител путем ковалентного связывания гаптеиной детерминанты с формалинизированными эритроцитами барана, о т ., и ч а ю 1Д. и и с я тем, что, с целью выявления антител к атропину,в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукцинат атропина в концентрации 0,12-0,1 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:0,83 ,0, осу1цествля1от водным раствором карбодиимида в концентрации 0,120 ,1 ммоль/мл при рН ,0 и темпе ратуре 1б-2Пс в течение 12-15 ч. 2. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител путем ковалентного связывания гаптенной детерминанты с формалинизировлнными эритроцитами барана, отличающийс я тем, что, с целью выявления антител к атропину, в качестве гаптенной детерминанты используют пв -(антропин-азо)-бензойную кислоту в концентрации 0,01-0,12 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами , взятыми в объемном соотношении 1:5,,5, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,08-0,1 ммоль/мл при рН 5,86 ,0 и температуре 1б-20 С в течение 1 12-18 ч. ю 4 vJ

„„SU„„1079247

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.А си A 61 K 39/38 ь дс !1 I45kli

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3419058/28-13 .(25) 3418226/28-13 (22) 08.02.82 (46) 15.03.84. Бюл. и 10 (72) В.К.!(озлоя, Ю.A.ÓÚ)áèìoâ, Г.А.Гурьянов, А.Я«Беспалов и С.Н.Голиков (71) Институт токсикологии (53) 615 375(088.8) (56) 1. Каральник fi.P. Эритроцитарные диагностикумы. Ч., !!Медицина!!, 1976 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТЛРНОГО

ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (ЕГО ВАРИАНТЫ) (57) 1. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител путем ковалентного связывания гаптенной детерминанты с формалинизированными эритроцитами барана, о т -, и ч а ю ш. и йс я тем, что, с целью выявления ан- тител к атропину,в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукцинат атропина в концентрации

0,12-0,14 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:0,83,0, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,120,14 ммоль/мл при рН 5,8-6,0 и темпе ратуре 16-20 С в течение 12-15 и.

2. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител путем кпвалентного связывания гаптенной детерминан ты с формалинизированными эритроцитами барана, о т л и ч à ю щ и йс я тем, что, с целью выявления антител к атропину, в качестве гаптенной детерминанты используют и-(антропин-азо)-бензойную кислоту в концентрации 0,01-0,12 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:5,4-13,5, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,08-0,1 ммоль/мл при рН 5,86,0 и температуре 16-20 С в течение

12-18

79247 з

По второму варианту в качестве гаптенной детерминанты используют и-(атропин-азо)-бензойную кислоту

s концентрации 0,01-0,012 ммоль/мл и ковалентное .связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:5,4"13 5 осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,08-0,1 ммiль/мл при

1о рН 5,8-6,0 и температуре 16-20 С в течение 12-18 ч.

Первый вариант выполнения способа.

А. Получение Формалинизированных . эритроцитов барана.

1. Воздействуют 6 объемами 34 мас./ раствора Формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2 íà l объем 40-60 мас.3-ной суспензии от белков сыворотки эритроцитов барана в течение 2-3 ч при 16-20 С, дополнительно воздействием 2-2,5 объемами 35-40 мас.Фного раствора Формальдегида в течео ние 20-24 ч при 4-6 С.

2. Формалинизированные таким образом эритроциты многократно отмывают в 50-100-кратном избытке физиологического раствора с рН 6,8-7,4 и ресуспензируют до концентрации

40-60 мас.3 в физиологическом растворе.

Б. Синтез гемисукцината атропина согласно Fasthetal (8)по реакции б бн,-C = о

6НВ О

Обн-(!н-бн Он

СН вЂ” (.= О 6 4

- н,>-оОо-он-Он,о-Оо-(Он)-Ооон

В. Конъюгирование гемисукционата атропина с формалинизированными эритроцитами барана.

К одному объему 4Ч-60 мас./ суспензии формалинизированных эритроцитов барана п.%. на физиологическом растворе (0,15 И раствор йаС!) при перемешивании добавляют 0,83;0 объема водного раствора гемисукцината атропина при концентрации

Онl " 0,12 ммоль/мл и рН 5,8 - 6,0 (используют только свежеприготовленный раствор гемисукцината атропина, см п.Б), К смеси эритроцитов и гемисукцината атропина прикапывают .1,01 10

Изобретение относится к иммунохимии и фармакологии, преимущественно, к применению эритроцитарных диагностикумов, и может быть использовано для выявления в биологических средах антител к низкомолекулярным биологически BKTNsHHN соединениям.

Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов с детерминантами различных антигенов и гаптенов, основанные на ковалентном связывании детерминанты с .эритроцитами С!1.

Однако известные способы получения эритроцитарных диагностикумов не позволяют получить диагностикум с гаптенной детерминантой атропина.

Целью изобретения является выявление антител к атропину.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител по первому варианту в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукционат атропина в концентрации 0,120,14 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении l:0,8-3,0, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,120;14 ммоль/мл при рН 5,8-6,0 и темпе ратуре 16-20 С в течение 12-15 ч.

-4,0 объема водного раствора водорастворимого карбодиимида при концентрации 0,12-0,14 ммоль/мл. При добавлении раствора карбодиимида смесь перемешивают и поддерживают рН 5,8 - 6,0 с помощью 0,5 í.HC 1 °

Реакционную смесь инкубируют в течение 12-15 ч при 16-20 С и рН . 5,8-6,0 без перемешивания.

Эритроцитарный осадок отмывают многократно Физиологическим раствором фосфатного буфера, рН 7,0 - 7,4 с центрифугированием.

Второй вариант выполнения способа

1079247

НООС

О он-щон б

О оо

А. Получение Формалинизированных эритроцитов барана проводится так же, как по первому варианту. нос о О нн

Нб1

3. Конъюгированне и-(атропин азо)

-бензойной кислоты с формалинизированными эритроцитами барана.

К одному объему 40-60 мас.б-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана (п.А) на физиологическом растворе (0,15М раствор NaC1!

l при перемешивании добавляют 5,4-13,5 объемов буферного раствора и-(атропин азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,91-0,012 ммоль/мл m (состав буфера : N,N-диметилформамид, 0,1 M боратный буфер, соотношение объемов ингредиентов 1:1, рН 8,8 - >0

9,0), рН реакционной смеси доводят до 5,8 - 6,0, добавляя по каплям при перемешивании 1 н.НС1.

К смеси эритроцитов барана и п-(атропин азо)-бензойной кислоты 35 при перемешивании добавляют по каплям 0,7-1,75 объемов водного раствора водорастворимого карбодиимида с концентрацией 0,08-0,1 ммоль/мл при рН 5,8-6,0. 40

Смесь инкубируют при комнатной температуре 16-20 С в течение 12о

-18 ч, рН 5,8-6,2.

Эритроцитарный осадок отмывают многократно в избытке физиологичес- 45 кого раствора Фосфатного буфера, рН 7,2-7,4) с центрифугированием.

Способ по первому варианту поясняется следующими примерами.

Пример 1. Синтез гемисукци- 50 ната атропина. 150 мг атропина основания растворили в 2 мл сухого хлороформа при комнатной температуре. К раствору добавили 115 мг янтар-, ного ангидрида и смесь перемешивали 55 в течение 2 ч на магнитной мешалке.

Затем хлороформ удалили фильтрацией и выпариванием осадка в вакууме.

Б. Синтез и-(атропин азо)-бензойной кислоты, Согласно Murzburger

et,а1. по реакции. нооо О m — н— е сР

Оставшуюся маслянистую жидкость раст. ворили в 3 мл дистиллированной воды и установили рН 5,8, прибавляя

2 н,Na0H.

Пример 2. Синтез гемисукцината атропина вели в условиях примера 1, только раствор гемисукцината атропина имел рН 6,0.

Установка рН 5,8 - 6,0 является необходимым условием получения высокочувствительного эритроцитарного диагностикума. При несоблюдении этого условия диагностикум имел чувствительность выявления в реакциях агглютинации антител к атропину ниже в

4 - 8 раз.

Далее гемисукцинат атропина для конъюгирования с эритроцитами готовили как в примере 1.

Пример 3. Получение Формалинизированных эритроцитов барана.

Эритроциты барана отмывали забуференным Физиологическим раствором при центрифугировании, отделяли эритроцитарный осадок, готовили

604-ную эритроцитарную суспензжю на физиологическом растворе фосфатного буфера. К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов 34 -ного раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь инкубировали в течение

3 ч и затем дополнительно прибавляли к смеси 2 объема 40 -ного раствора формальдегида и инкубировали смесь о при 4 С в течение 20 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 100-кратном избытке Физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании, рН 7,4 и ресус- . пензировали до концентрации 50 мас.ф

$ 10792 в Физиологическом растворе фосфатного буфера с рН 7,2.

Пример 4. Эритроциты барана отмывали забуференным физиологическим раствором, отделяли осадок эритроцитов, готовили 40 мас.3-ную эритроцитарную суспензию на Физиологическом растворе Фосфатного буфера.

К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов 4ô-ного 10 раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь ийкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и затем дополнительно прибавляли к смеси 2,5 объема

353-ного раствора формалина и инку бировали смесь при 6 С в течение

24 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 50-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера ори центрифугировании, рН 7,0 и ресуспензировали до концентрации 40/, в физиологическом растворе фосфатного буфера, рН 7,2. 25

Пример 5. Эритроциты барана формалинизировали в условиях примеоа 3, только полученный эритроцитарный осадок отмывали 10-кратно в 50кратном избытке физиологического раствора Фосфатного буфера с рН 6,8 и ресуспензировали до концентрации

60 в Физиологическом растворе фосфатного буфера с рН 7,2.

Варьирование в условиях Формалинизирования эритроцитов (примеры

3-5) не оказывало существенного влия ния яа чувствительность и сохранность эритроцитарных диагностикумов, которые били приготовлены на основе этих эритроцитов.

Пример 6. Конъюгирование гемисукцината атропина с формалинизированными эритроцитами барана с помощью водорастворимого карбодиими. да N-циклогексил"й-jP(N-метилморфолиино)-этил) .карбодиимид-и-толуол сульфоната.

0,15 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 0,75 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8, прибав-. ляя по каплям 2,0 н.йаОН, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл 503-ной суспензии Фор-. малинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе, К смеси гемисукционата атропина и Формалинизированных эритроцитов по каплям прикапывали раствор 0,14 N-цик47 а логексил-N-(P (й-метилморфолиино)-этил) карбодиимид-и-толуол сульфоната в мл дистиллированной воды, при этом смесь перемешивали и поддерживали рН 5,8 добавлением в реакционную смесь 0,5 í ° HCE. Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 12 ч без перемешивания, Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали восьмикратно

50-кратным избытком Физиологического раствора фосфатного буфера с рН 7,2.

Пример 7. 0,31 ммоль гемисукцината атропина растворяли в

1,5 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 6,0, прибавляя по каплям

2,0 н.NaOH, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл

603-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологи ческом растворе, 0,28 ммоль й-циклогексил-N-(p(й-метилморфолиино)-этил 3 карбодиимид-и-толуол сульфоната раст воряли в 2,0 мл дистиллированной воды и по каплям добавляли к смеси гемисукцината атропина и Формалинизированных эритроцитов барана, перемешивая смесь и поддерживая рН 6,0 добавлением 0,5 н.НС1. Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 15 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали пятикратно 100-кратным избытком физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7,2.

Пример 8. 0 075 ммоль гемисукцината атропина растворяли в

0,35 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8, добавляя в раствор по каплям 2н.Na0H, и при перемешивании полученный раствор прибавляли к 0,5 мл 403-ной суспензии Формали-, низированных эритроцитов барана" на

Физиологическом растворе, К смеси гемисукцината атропина и эритроцитов по каплям при перемешивании добавляли 0,07 ммоль й-циклогексил-.й-(7S(N

-метилморфолиино)-атил)карбодиимид-

-п-толуол сульфоната в 0,5 мл дистиллированной воды, при этом рН

5,8 реакционной смеси поддерживали добавлением 0,5 í.НС7 После этого реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 12 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали семикратно 50-кратным избытком физи

79247

7 10 ологического раствора фосшатного буфера, рН 7,2.

Пример 9. Получение эритроцитарного диагностикума проводили в условиях примера 6, только к смеси гемисукцината атропина и Формалинизированных эритроцитов прибавляли раст вор 0,14 ммоль солянокислого 1-этил

-3-(3-диметиламинопропил) карбодиими да в 1 мл дистиллированной воды. Далее синтез эритроцитарного диагностикума вели в условиях примера 6.

Пример 10. Получение эритроцитарного диагностикума проводили в условиях примера 8, только к смеси гемисукционата атропина и формалинизированных эритроцитов прибавляли

0,08 ммоль солянокислого 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в 0,5 мл дистиллированной воды, при этом рН 6 реакционной смеси поддерживали прибавлением по каплям

0,5 н.раствора НС1. Далее синтез эритроцитарного диагностикума проводили в условиях примера 8.

Пример 11.0,62 ммоль гемисукцината атропина растворяли в

3 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8, прибавляя по каплям 2,0 н.NaOH, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл 503-ной суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе.

0,56 ммоль N-циклогексил-N-(р(Ч-метилморфолиино)-этил) карбодиимид-п-толуол сульфоната растворяли в 4,0 мл дистиллированной воды и ,по каплям добавляли к смеси гемисукцината атропина и Формалинизированных эритроцитов барана, перемешивая смесь и под.держивая рН 5,8 прибавлением по каплям 0,5 н.НС1. Затем реакционную смесь инкубировали без перемешивания в течение 12 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали пятикратно 100-кратным избытком физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7,2.

Пример 12. 0,04 ммоль гемисукцината атропина растворяли в

0,2 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8 и при перемешивании этот раствор прибавляли к 0,5 мл

504-ной суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе. Далее к смеси гемисукцината атропина и эритроцитов добав-1 ляли при перемешивании 0,035 ммоль

N-циклогексил-9 fP(N-метилморфоли-, ино)-этил ) карбодиимид-и-толуол сульфоната в 0,3 мл дистиллированной

5 воды, рН реакционной смеси 5,8. 3атем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 12 ч. Эритроцитарный осадок отмывали пятикратно в 100-кратном избытке Физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7.,2.

П р и м е о ы 13-15. Подготовка эритроцитарного диагностикума к ис15,пользованию в РНГА (реакция непрямой агглютинации) или к длительному сохранению.

Эритроцитарные диагностикумы, получение которых описано в приме20 рах 6-12, после отмывки физиологическим раствором фосфатного буфера ресуспензировали до концентрации

14 в 1 -ной прогретой кроличьей сыворотке, адсорбированной нативными

25 эритроцитами барана (+56 С, 30 мин), в 13-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, 13-ного раство- ра полиглюкина, которые готовили на физиологическом растворе фос3О фатного буфера, рН 7,2 ° Эритроцитарные диагностикумы готовили для длительного хранения путем быстрого замораживания 53-ной суспензии сенсибилизированных эритроцитов в

53-ной инактивированной от комплемента и адсорбированной эритроцитами барана кроличьей сыворотке в смеси сух4го льда и ацетона (ампулы с диагностикумом предварительно запа4О ивали) и сохраняли до использования о при -30 С. Дальнейшее испытание диагностикумов не выявило преимуществ ни одного из использованных растворов высокомолекулярных соединений, 45 поэтому в своднои таблв 1 представ лены результаты определения в РНГА специфичных к атропину антител, которые были получены с диагностикумами, полученными согласно примеров

6-12, в виде 13-ной суспензии на

-13-ной кроличьей сыворотке.

Пример 16. Испытание эри троцитарных диагностикумов,приго.товленных в условиях примеров 6-12

55 в РНГА со специфичными к атропину референс (тест) - сыворотками.

Эритроцитарные диагностикумы, получение которых описано в примерах

6-12, тестировали в PHI A co специ9247

Зо

9 107

Фичными к атропину донорскими тестсыворотками, которые получали от экспериментальных животных при иммунизации последних искусственными конъюгированными антигенами с атропином в качестве гаптена. На основа. нии результатов определения чувствительности приготовленных диагностичсумов по выявлению специфичных к атропину антител в тест-сыворотках делали вывод об эффективности процедуры их синтеза (примеры 6-12).

Реакцию непрямой гемагглютинации ставили в модификации по микрометоду по стандартной методике. Полученные результаты представлены в . табл.!.

Анализ полученных результатов позволил заключить,что наивысшей чув ствительностью при определении специфичных к атропину антител в РНГА» обладают эритроцитарные диагностикумы, которые приготовлены в условиях примеров 6-11, однако диагностикум, приготовленный согласно условиям примера 11,неспецифически агглютинировал в присутствии неимунной (контрольной) кроличьей сыворотки, что делает невозможным его помощью определение специфичных антител, Таким образом, условия примеров 6-10 являются оптимальными при синтезе эритроцитарных диагностикумов с гаптенной детерминантой - химически модифицированным атропином.

Пример 17. Испытание зритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6"10, после длительного хранения в виде консервайта.

Эритроцитарные диагностикумы, полученные в условиях примеров 6-10, хранили до 6 мес в замороженном сос. тоянии в виде 53ной суспензии на

53-ной инактивированной от комплемента прогреванием кроличьей сыворотке, предварительно адсорбипован" ной нативными эритроцитами. барана.

Показали, что сенсибилизированные эритроциты до 4 мес. сохраняют спе-. цифичную чувствительность при определении в РНГА антител к атропину °

После оттаивания их физико-химические свойства и чувствительность практически не меняются.

П р и и е р 18. Испытание чувствительности определения в РНГА специфичных к атропину антител, 5

Ео

Для доказательства специфичности определения в РЙГА антител к атропину с помощью эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6-10, с этими диагностикумами и тест сыворотками ставили реакцию торможения непрямой гемагглютинации атропином. РНГА тормозили атропином в концентрации 0,5-5,0 мг/

/мл. Примеры некоторых экспериментов с соответствующими результатами сведены в табл.2. Таким образом, РНГА между эритроцитами с гаптенной детерминантой - химически модифици- . рованным атропином и специфичными к атропину антителами тормозится атро" пином, добавляемым в реакционную фазу что свидетельствует о специфичности эритроцитарного диагностикума по отношению к выявлению с его помощью антител к атропину.

Как видно из примеров .конкретного выполнения и данных таблиц, пред. лагаемый способ решает создание эритроцитарного диагностикума,. специфич, но определяющего в. РНГА антитела к атропину. Эритроцитарный диагностикум с гаптенной детерминантой - химически модифицированным атропином (гемисукцинат атропина, ковалентно связан-. ный с эритроцитдрной ОболОчкОЙ имиЯной связью), приготовленный по предлагаемому методу, позволяет с высокой чувствительностью определять в реакциях гемагглютинации антитела к атропину (отдельные референс-сывоворотки.имели значение обратного титра к атропину 2560 и вышеj, определение антител специфично, что доказано торможением РНГА свободным атропином, Использование в качестве гаптенной детерминанты эритроцитарного диагностикума гемисукцината атропина позволило сохранить обе детерминанты антигенной специфичности атропина: тропиновую часть и ароматическое кольцо - удаляет их от обо . лочки эритроцитов, что способствует выявлению с помощью такого диагностикума всей популяции антител, высоко специФичных к атропину. Этой же цели служит и использование в качестве агентов, формирующих ковалентное связывание, гептенной детерми" нанты - химически модифицированного атропина, водорастворимых карбодиими; дов, соединений лишь активирующих формирование имидной связи, но не входящих в окончательный продукт

12 нооо Q мн — оо О =- —.

NaMO нбвд ДЭ!

5 бн,он

dH- бΠ— О ,р11 107924 реакции - эритроцитарный диагностикум, а следовательно, не влияющих на специфичность последнего при распознавании с его помощью антител к атропину в РНГА. Эритроцитарный s диагностикум, приготовленный в усло- . виях примеров 6-10, 13-15 не теряет специфичной чувствительности при хранении 4-6 С в течение 2 мес. без о консерванта, а в присутствии консер-, и-Аминобензойную кислоту 10,3 мг (0,075 ммоль) растворяли в 1,5 мл

0,25-0,2 И НС1 и раствор охлаждали до 4-6 С на ледяной бане. К этому раствору по каплям при перемешива-, нии на ледяной бане добавляли охлаж- у0 денный водный раствор нитрита натрия (6,9 мг в 0,6 мл воды) ° Реакционную, смесь инкубировали в течение l ч при перемешивании на ледяной бане.

После окончания срока инкубации в реакционной смеси добавляли

0,025 ммоль сульфаминовой кислоты (2,5 мг в 0,3 мл охлажденной воды), 58 мг атропина сульфата (0,1 ммоль) растворяли и К-диметилформамидном - 1 боратном буфере; соотношение М1й-диметилформамид, 0,1 М боратный буфер =

= 1:1, рН 9,0. Раствор охлаждали до 4-6 С и при перемешивании к этому раствору прибавляли весь объем полученной реакционной смеси.

Реакционную смесь инкубировали в тем о ноте в течение 4 ч при 4-6 С, перемешивая, noñëå чего рН реакционной смеси доводили до 5,8, добавляя по каплям 1,0 н.НС1.

Пример 2. и-(Атропин-азо)-бензойную кислоту получали в условиях примера 1, только после окончания срока инкубации реакционной смеси рН доводили до 6,0, добавляя

1 Н.НС1, Пример 3. Получение форма линизированных эритроцитов барана. ванта при замораживании и хранении при (-30) - (-40оС) - в течение

4-6 мес.

Способ по второму варианту поясняется следующими примерами.

Пример 1. Синтез и-(атропин азо)-бензойной кислоты (химически.. кая модификация атропина азосочетанием с и-аминобензойной кислотой) по реакции

Эритроциты барана отмывали забуференным физиологическим раствором при центрифугировании, отделяли эритроцитарный осадок, готовили

50 мас.3-ную суспензию эритроцитов на физиологическом растворе фосфатного буфера. К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов 3 мас.3-ного раствора формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь инкубировали в течение 3 ч и затем дополнительно прибавляли к смеси 2 объема 40 мас.ь-но го раствора формальдегида и инкубировали смесь при 4 С в течение

20 ч, Полученный эритроцитарный оса". док 8 раз отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора

Фосфатного буфера при центрифугиро" вании, рН 7,4 и ресуспензировали до концентрации 50 мас.3 в физиологическом .растворе Фосфатного буфе" ра, рН 7,2.

Пример 4. Эритроциты барана формалинизировали в условиях примера 3, только для Формалинизирования готовили 60 масД-ную суспензию эритроцитов барана.

Пример 5. Эритроциты барана отмывали забуференным физиологическим раствором, отделяли осадок эритроцитов, готовили 40 мас.3-ную зритроцитарную суспензию на физиологическом растворе фосфатного буфера. К однойу объему эритроцитарной суспензии до13

1079247

15

30 бавляли 6 обьемов 4 мас. -ного раствора формальдегида в Фосфатном буФерном растворе, рН 7,2. Смесь инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и затем дополнитель но прибавляли к смеси 2,5 объема

35 мас.Ф ного IpacTaopa Формалина и инкубировали смесь при +6"С в течение 24 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в

50-кратном избытке Физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугироваиии, рН 7,0, и ресуспен,зировали до концентрации 40 мас.3 в физиологическом растворе фосфатного буфера,рН 7,2. Варьирование в условиях формалинизирования эритроцитов (примеры 3-5) не оказывало существенного влияния на чувствительность и сохранность эритроцитарных диагностикумов, приго- " товленных на основе этих эритроцитов.

Пример 6. Конъюгирование п(атропин азо)-бензойной кислоты с

Формалиниэированными эритроцитами барана в присутствии инициатора типа водорастворимых карбодиимидов-й-циклогексил-й-fp(N-ме тилморфоли-, ино)-этил) карбодиимид-п-толуол сульфоната.

К 0,5 мп 403-ной суспензии Формалиниэированных эритроцитов барана . на физиологическом растворе при перемешивании добавляли 13,5 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией

0,01 ммоль/мл, а затем по каплям

1,75 мл водного раствора й-циклогексил-N-(((й-метилморфолиино)-этил 40 карбодиимид-и-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь инкубировали при 16 С в течение о

12 ч, рН 5,8. Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора Фосфатного буфера (0,15 И йаС1, 0,075 И Фосфатов, рН 7,2) .

Пример 7. !(0,5 мл 504-ной суспензии Формалинизированн ух эритроцитов барана на Физиологическом растворе при перемешивании добавляли

6,75 мл буферного раствора и-(атропин-aso)-бензойной кИслоты с концент- 55 рацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 0,87 мл водного раствора й-циклогексил-й-$P>(N-метилморфолиино)-атилла карбодиимид-и-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Далее синтез продолжали в условиях примера б.

Пример 8. К 0,5 мл 503-ной . суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе при перемешивании добавляли 4,0 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 0,52 мл водного раствора Ч-цикло гексил-й-((й-метилморфолиино)-этил ) карбодиимид-и-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь о инкубировали при 16 C без перемешивания в течение 12 ч, рН 5,8. 0садок инкубированных эритроцитов много кратно отмывали в 50-кратном избытке Физиологического раствора фосфатного буфера.

Пример 9. К 0,5 мл 403-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе при перемешивании добавляли

4,0 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,12 ммоль/мл, а затем по каплям 0,52 мл водного раствора й-циклогексил-И-((й-мeтилмnphoлиино)-этил1 карбодиимид-и-толуол сульфоната с концентрацией О, 1 ммоль

/мл. Смесь инкубировали при 20 C. без перемешивания в течение 16 ч, рН 6,0, Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмывали в 100кратном избытке физиологического раствора Фосфатного буфера при центрифугировании.

Коньвгирование и-(атропин-аэо)-бензойной кислоты с формалинизированными эритроцитами барана в присутствии инициатора типа водорастворимых карбодиимидов - солянокислого

1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.

Пример l3. К 0,5 мл 501-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологическом растворе Фосфатного буфера при перемешивании добавляли 4,0 мл буферного раствора Il (атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/

/мл, а затем по каплям 0,52 мл водно. го раствора солянокислого 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь е инкубировали при 20 C без перемешива15 ния в течение 16 ч, рН 5,8. Осадок инкубированных эритроцитов многократ но отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера.

Пример 14. К 0,5 мл 503ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологическом растворе фосфатного буфера при перемешивании добавляли 2,7 мл hyферного раствора п-(атропин-азо)-бен. зойной кислоты с концентрацией

0,01 ммоль/мл, а затем по каплям

0,35 мл водного раствора солянокислого 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида с концентрацией

0,08 ммоль/мл. Смесь инкубировао ли при 18 С без перемешивания в течение 18 ч, рН 6,0. Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера.

Эритроцитарные диагностикумы, получение которых описано в примерах

6-14, в реакциях гемагглютинации использовали в виде 1,3,53-ных суспензий. Суспензии готовили на 1 ной прогретой при 56 С в течение

30 мин и абсорбированной нативными эритроцитами барана нормальной (неимунной ) кроличьей сыворотке, 13-ном растворе человеческого или бычьего сывороточного альбумина, на 1 -ном растворе полиглюкина, которые, в свою очередь, готовили на Физиологическом растворе фосфатного буфера, рН 7,4. Эритроцитарные диагностикумы для длительного хранения получали путем быстрого замораживания 54-ной суспензии гаптенированных эритроци- тов на 5/-ной инактивированной от комплемента прогреванием и абсорбированной нативными эритроцитами барана нормальной кроличьей сыворотке в смеси сухого льда и ацетона (диагностикум предварительно ампулировался). Замороженный диагностикум хранили при (-30) - (-40) С.

Существенных различий в.чувствительности диагностикумов, приготовленных на 13-ной сыворотке, 13-ных растворах альбумина, 1l-ном растворе .полиглюкина, не выявили. Чувствитель ность при определении специфичных к атропину антител зависела от соот ношения ингредиентов реакции на ста дии коньюгирования и-(атропин азо)-бензойной кислоты с эритроцитами.

79247 16

Из представленных данных видно, что эритроцитарные диагностикумы с гаптенными детерминантами и-(атропин-азо)-бензойной кислоты, приготов.

45 ленные в условиях примеров 7-11

Ф

13 и 14, пригодны для выявления в

РНГА специфичных к атропину антител. Оптимальными условиями получения диагностикума являются условия

50 примеров 7-9 и 13, диагностикумы, по.

-лученные в этих условиях, имеют на- ибольшую чувствительность. Диагности кум, полученный в условиях примера

6, непригоден из-за его неспецифической агглютинации в присутствии нормальной кроличьей сыворотки.Диагностикум, полученный в условиях примера 12,малопригоден из-за его низкой чувствительности.

Наибольшую чувствительность имели диагностикумы в виде 13-ной суспензии гаптенированных эритроцитов, поэтому в табл.1 представлены результаты, полученные при тестировании эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров

6-14 при условии, что испытовались гаптенированные диагностикумы в виде 13-ной суспензии на 13-ной нормальной кроличьей сыворотке.

Эритроцитарные диагностикумы, получение которых олисано в примерах

6-14, тестировали в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) на чувствительность выявления антител к атропину. Для определения чувствительности диагностикумов по вь1явлению специфичных к атропину антител использовайиб референс (тест)-сыворотки от животных доноров, которых иммунизировали белковыми антиге-нами с гаптенной детерминантой атропина. Референс-сыворотки получали по общепринятой методике, инактивировали комплемент прогреванием и абсорбировали нативными эритроцитами барана. РНГА ставили в модификации по микрометоду на планшетах микротитратора "Такачи" общепринятым способом. В качестве контрольной использовали нормальную кроличью сыворотку - тест на неспецифичную аг глютинацию диагностикумов в присутствии сывороточных белков. Результаты оценки и чувствительности зритроцитарных диагностикумов по выявлению в РНГА специфичных к атропину антител сведены в табл.1.

17 10792

Диагностикумы, приготовление которых описано в примерах 7-11, 13 и

14, испытывали на сохранность при хранении без замораживания и при замораживании. Оказалось, что;эти 5

0 диагностикумы стабильны при 4 С в течение месяца и не теряли специфичной к атропину чувствительности.

При замораживании в присутствии консерванта (Я-ная инактивирован- >0 ная от комплемента кроличья сыворотка, абсорбированная нативными эритро цитами барана) в виде 53-ной суспензии с последующим оттаиванием перед использованием чувствительность 15 эритроцитарных диагностикумов не снижалась в течение 4-6 мес. Диагнос. тикумы, получение которых описано в примерах 7-9 и 13, испытывали в реакции торможения гемагглютинации 20 (РТНГА) на специфичность выявления антител к атропину и к структурному аналогу атропина - тропацину, содержащему тропиновую группировку. Испытывали также специфичность диагности- 25 кума по выявлению влияния других холинолитиков, имеющих отдаленное химическое сходство с молекулой атропина (циклозил, трибутам), Оказалось, что диагностикум имеет высо- З0 кую специфичность при выявлении антител к атропину, приче м хорошо выявляет антитела, специфичные к тропиновой части молекулы атропина.

Другие холинолитики практически не тормозят РНГА между гаптенированным диагностикумом и специфичными к атропину сыворотками. Полученные результаты, представлены в табл.2.

Таким образом, эритроцитарный диагностикум с гаптенными детерминантами химически модифицированного . атропина. (n- (атропин-аэо) -бензойная кислота, ковалентно связанная с зрит 45 роцитами барана), приготовленный по предлагаемому методу, позволяет с высокой чувствительностью определять .в реакциях гемагглютинации анти. тела к атропину (отдельные референс-сыворотки имели значение обратного титра к атропину 1280 и выше), определение антител специфично,что доказано торможением РНГА свободным антропином. В то же время, диагностикум избирательно выявляет антитела, специфичные к токсофорнойтропиновой части молекулы атропина, 47 18 что доказано способностью структурного и фармакологического аналога атропина - тропацина также тормозить РНГА однако значительно хуже, чем атропин. Использование в качестве гаптенной детерминанты эритроцитарного диагностикума — n-(атропин-азо)-бензойной кислоты не изменяет тропиновой части молекулы атропина и обеспечивает введение в его молекулу химической группировки, необходимой для последующего ковалентного связывания модифицированного атропина с оболочкой эритроцитов. Согласно изобретению ковалентное связывание модифицированного атропина с ооболочкой эритроцитов достигается путем использования инициаторов типа водорастворимых карбодиимидов, которые не входят в окончательный продукт реакции - гаптен-эритроцит барана, а следовательно, не оказывают влияния на специфичность эритроцитарного диагностикума в процессе распознавания с его помощью активного центра антител к атропину при их выявлениях в реакциях гемагглютинации; с другой стороны, присутствие, в и фтропин-азо)-бензойной кислоте, ковалентно связанной с Формалинизированными эритроцитами барана ииидной связью, молекулярной вставки между тропиновой частью и оболочкой эритроцитов удаляет эту детерминанту иммунохимической специфичности от эритроцитарной оболочки, что способствует выявлению в реакциях гемагглютинации антител, специфичных к токсофорной тропиновой части атропина с высокой чувствительностью. В итоге, изобретением решена задача создания эритроцитарно го диагностикума, специфично определяющего в реакциях гемагглютина- ции антитела к атропину и избиратель но к тропиновой группировке. Эритроцитарный диагностикум с гаптенными детерминантами химически модифицированного атропина может быть использован в лабораторной исследовательской практике для определения антительной продукции к антропину, исследования специфичности антител к атропину, а также в клинической практике для определения в простых и рас пространенных реакциях гемагглютинации антител к атропину у пациентов, поинимаюших атропин.

1079247 20

Таблица

1 .Чувствительность испецифичность эритроцитарных диагно- стикумов с гаптенной детерминантой остатка гемисукционата атропина при определении в референс-сыворотках специфичных к.атропину антител

19 йтр референс"сыворотки в РНГА и РТНГА ритроцитарный диагностикум, приготовленный в условиях примера

6 7 8 9 12

160

10 10 20 10

0 10

0 0

Референсаыворотка

6401280640 - 320 - 320 + 801280 - 640 - 640 + 1601280 - 320

2560 - 6401280 - 5120 - 2560 - 5120 - 2560 - 1280 + 320320 - 160160 - 160 — 80 +

П р и м е ч а н и е: (+) - неспецифическая агглютинация в НКС (контроль); (-) - отсутствие агглютинации в контроле

:Количество атропина сульфата в а.25-10 г, где а

32 0320

160

320 - 80 - 160 - 80 - 80 + 40

0 0 0 0 10 0

640 - 640 - 640 - 640 - 320 + 801280 - 640 - 1280 - 640 - 640 + 1601079247

22

Табл и ца 2

Специфичность эритроцитарного диагностикума с гаптенной детерминантой остатка гемисукцината атропина при выявлении антител, специфичных к атропину, в РНГА и PTHIA с атропином и другими холинолитиками

Рефкренс-сывортка. специфичная к

- О O- н

ЯЯБ -О0 Π— бй-бН О dO (бк,j;CO-МН :С@ 0CO — СН

О гаптену гаптену

Торможение РНГА атропин а 25.1О r гае а а е А е ЪФ

1 1 10

20 10 0 титра

РНГА титр

РНГА

320

640 20

320 10

2 320 20 10

3 160 20 10

160

4 40

5 40

6 20

40 20

20 10

20 10

10

20

Титр тест-сыворотки при добавлении для РНГА р-ров исследуемых веществ

Титр тестсыворотки в контро" ле Физ.p-pe циклозил трибутам тропацин

0,5мг/мл 5 мг/мл

5мг/мл

5 мг/мл 5 мг/мл

40 +

20

20

40+

20

20

80 +

80 +

320

160 +

320 +

40

320

80

320 +

640

640 +

10

58+9,1

75 5,1

91<3 3

Степень ингибирования

РНГА

57+9,3

Il р и м е ч а н и е: В реакционную фазу для торможения вносили растворы исследуемых веществ в объеме ы 25 .10 л

Сыво ротка, Ю

Оценка невозможна (неспецифическая агглютинация) Торможение PHIA атропин а 25 10 г гае а

° е

1 J 5 J 10

1079247

Таблица

Чувствительность и специфичность зритроцитарных диагностикумов с гаптенной детерминантой остатка и-(атропин-аэо)-бенвойной кислоты при определении в референс-сыворотках специфичных к атропину антител

1 ю Ф» «4Ф ю

Титр референс-сыворотки в РНГА и РТНГА

) 1

Эритроцитарный диагностикум, приготовленный в условиях примера

6 7 8 9 10 11 Т2 13 14

Т - « +

160 320 320 320 320 160

40 20 10 10 10 10

10 10 0-10 0-10 0-10 0 .

0 0 0 0

10 10 & (+) - неспецифическая агглютинация в 13 р-ре НКС (контроль);

4« () - неявная агглютинация в контроле;

«""(-) - агглетинация отсутствует в контроле ав

Референссыворотка для РНГА

256А 1280 640 320 2560 1280

1280 1280 320

160

1280 640

640

320 320 640

640 640 320 80

320

16о Зго Зго

160

160

320 320

320

160 160

160 160 160

160 160

80 80 40 10

80 80

+ +

80

40 количество атропина сульфата в а-25-10 г, 9 где а

640 1280 2560

+ +

320 640 1280

80 320 160

10 10 10

0 .10 9

0 0 0

1079247

Табл ица 4 эритроцитарного диагностикума с гаптенной остатка и-(атропин-азо)-бензойной кислоты антител, специфичных к атропину, в РТНГА другими холинолитиками..Ф

Специфичность детерминантой при выявлении с атропином и

»е«» ° й»м «еа.е» »

Реееренс-сиерротка, спекифиинаа к»е Qpy>»а»» а»ар »»- -»»»ии1,»иайаеО»»»-»» Яф

О сн,он гаптен гаптену

Сыво ротк

«««е»»««»»»»»»»»

Тороможение РНГА атропин, а 25 10 r где а

«в«а««4«» «

1 J 5 10

«» «

««» ««

Титр в РНГА

Торможение РНГА,атропин а 5 гад» «

20

640 20 10 0

1О 0 0

2 20 !О 0

10 10

10 ° 0

20 10

20 20

20 10. 320

20 1О О 0

160

20 0 О

5 !О 10 0

40

0 0

6 10 О

20

40

80

20

80

80

20

40

40

40

10

160

40

80

320

80

160

160

320

1О

160

640

160

320

320

fl р и м в ч а н и е : В реакционную фазу для торможения вносили растворы исследуемых веществ в объеме

25.10-Ь л

ВНИИПИ Заказ 1197/4 Тираж 688 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4