Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕННЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ , предусматривающий экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммония,отличающийся тем, что, с целью повьшения сохранения активности фермента экстрагирование осуществляют 3 М раствором хлористого калия при соотношении 1:

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

З1511 С 12 М 9/16

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И О 1НРЫТИИ (2 1) 3406 130/28-13 (22) 04.03.82 (46) 30.03.84. Бюл . У I2 (72) А.M.Голубев, О.В.Морозкин, П.П.Кулагин и M.А.Володин (71) Астраханский государственный медицинский институт им. Л.В.Луначарского (53) 577.15 (088,8) (56) 1. Lehman Г.Y., Lehman D. heganisoenzyme iso)irung der alkalischen

Phosphatase aus Menschlicher Plazenta und Entwichluny, einer empfindlichen Methode fiir die Tumordiagnostik — Wern Dtsch Ger Alm Med

80 Kongr., Wiesbaden, 1974, 16581661.

„.SU„„28) ) А (54) (57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕННЯ 7ЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью повышения сохранения активности фермента экстрагирование осуществляют 3 M раствором хлористого калия при соотношении

1:(3-4), для фракционирования используют 1,0-1,57-ный раствор хло-. ристого цетилпиридиния в 4-5-кратном избытке к обрабатываемому раствору и сульфат аммония в количестве 3065Х от степени насыщения.

1082811

Цель изобретения — повышение сохранения активности фермента.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирова35 ние белков из раствора сульфатом аммония, экстрагирование осуществляют

3М раствором КС1 при соотношении

1:(3-4), для фракционирования используют 1,0-1,57-ный раствор хлористого цетилпиридиния в 4-5-кратном избытке к обрабатываемому раствору и сульфат аммония в количестве 30-657 от степени насыщения.

Способ обеспечивает сохранение активности фермента до 727 °

Пример 1. Отмытую от крови человеческую плаценту (100,0 г) гомогенизируют при 8000 об/мин 5 мин.

Добавляют в соотношении 1:3 раствор

3 M KCI и перемешивают на магнитной мешалке при 4 С в течение 12 ч. Расто в ор це нт рифу гир уют при 6000 об /ми н

30 мин, Осадок отбрасывают, надосадочную жидкость диализируют против дистиллированной воды в 2 смены по

60 мин и против 0,1 н.раствора NaCI также в 2 смены по 60 мин. Экстракт прогревают при 65 С 10 мин.. К объему о

Изобретение относится к биохимии и медицине и касается способов вьщеления ферментов, в частности щелочной пллцентарной фосфатазы.

Известнс, что некоторые злокаче- 5 ственные опухоли обладают способностью к неосинтезу щелочной фосфатазы.

Значение, этого фермента весьма велико для клинических наблюдений.

Известен способ выделения термостабильной плацентарной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование фермента из сырья 307-ным бутанолом, фракционное осаждение ацетоном, кратковременную термообработку (обыч-15 но при 65 С), фракционирование белков сульфатом аммония (45-627), хроматографию ферментсодержащего раствора на диэтиламиноэтилсефадексе

А-50, гельфильтрацию на сефадексе

G-100 и кристаллизацию 1 j.

Однако данный способ обеспечивает сохранение активности фермента

+ 52,37 (органические растворители вызывают денатурацию белка и увели1 чивают потери активности) . исходного э ко тра 1 т ) | )и . нляют на магнитной мешалк . l,,—.(ûé раствор хлоpHcToI о цетилпир1Б1ииия В соотношении

1:4 и помещают н...(,.лод (-4 С) на о

60 мин. Экстрах (центрифугируют при

6000 об/мин 30 MIIH. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в 3,57.-ном растворе NBC1. Диализируют против дистиллированной воды

60 мин.

На следующем этапе н(»деления экстракт насыщают сернокислым аммонием (307) . Центрифугируют при 6000 oO/ìèí в гечение 30 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость насыщают

657-ным сернокислым аммонием. Проводят диали з . Це нтрифугир уют 6000 об /ми н

30 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в минимальном объеме трис-буфера (рН 8,6) .

После этих этапов пробы ставят в препаративный электрофорез на 2 ч в полиакриламидном геле. Окрашивают на щелочную фосфатазу: субстрат нафтил AS Îë-фосфат, краситель прочный синий RB-буфер веронал-мединаловый рН 8,6, Под визуальным контролем вырс дают фракции термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы I u I.I, т.е. получают в раздельном виде фракции изоэнзимов термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы I u II в чистом виде. Суммарное количество белка по Лоури 48 мг.

Пример 2. Отмытую от крови плаценту (100,0) гомогенизируют

7000 об/мин 5 мин. Добавляют 3 M

КС1 в соотношении 1:4 и перемешивают на магнитной мешалке в течение

14 ч. Раствор центрифугируют

5000 об/мин 25 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость диализируют в 2 смены против дистиллированной воды по 90 мин и в 2 смены по 90 мин против 1 н.раствора NaC1.

Экстракт нагревают при 68 С 12 мин.

Добавляют 1,57-ный цетилпиридиний хлористый в соотношении 1:5 на магнитной мешалке, помещают на холод (-4 С) на 90 мин. Центрифугируют со скоростью 5000 об/мин 20 мин.

Недостаточную жидкость отбрасывают, осадок растворят в 47.-ном растворе

NaC1. Диализируют против дистиллированной воды 90 мин.

На следующем этапе на(ыщак .: сернокислым аммони M в интсрвале 35607.. Центрифугирук>т со скор»ст>ю

5000 об/мин 20 мин. О(1, гок р;. тиоря—

I082811

Та бли ца 1

Результаты вьделения термостабильной щелочной плацентарной фосфатазы

Этап обработки

Вьделение фермента мг/мл мг (щ.ф.) мг (щ.ф .) мг щ.ф. иэ

I II общ.белка.7. мг

Начальный

Бутанольная экстракция

0,485

12970 12620

1,43

90,4

0,007

КС1-экстракция (предлагаемый способ) 12970 28600

2,2 811,2

0,062

2,8

Конечный выход

Известный способ

8,2 47,8. 5,83

47,3

5,78

Предлагаемый способ

4,8 565,9

118,2 567,8

4,77 99,5

П р и м е ч а н и е. Расчет производился по количеству щелочной фосфатазы (щ.ф.) в растворе бутанолового экстракта с учетом потерь в процессе выделения (прототип) и количеству выхода целевого продукта.

Таблица 2

Вьделение плацентарной термостабильной щелочной фосфатазы

Выделение фермента

Этап обработки мп Ед мг Вд/мг белка Выход,X

Экстракт плаценты после обработки 3 M хло100,0

400 14756 68000

2,17 ристым калием

1062 4,5

23,77

72,0

5,0

Конечный выход ют в минимальном обьеме трис-буфера (рН 8,6) . Пробы ставят в препаративный электрофореэ в полиакриламидном геле.

В результате осуществления пред5 лагаемого способа получены изоэнзимы термостабильной щелочной фосфатазы

I u II в чистом виде. Суммарное количество белка по Лоури 40 мг. Полученные фракции могут быть использованы для получения моноспецифических сывороток для использования н медицине .

Результаты выделения фермента приведены в табл. 1 и 2.

108281 1

Составитель О.Скородумова

Редактор Л.Пчелинская Техред Ж.Кастелевич Корректор Л.Шеньо

Заказ 4060 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фи.шал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Предлагаемым способом достигает- ся сокращение времени исследования на 7-8 сут, увеличение выхода целевого продукта в чистом виде из состава тканевых мембран в 5-6 раз, а 5 также при осуществлении предлагаемого способа требуется меньшее количество реактивов, исключается применение высокоскоростных рефрижераторных центрифуг и дорогостоящей аппаратуры.

Таким образом, способ обеспечивает сохранение активности фермента при выделении до 727.