Штамм bacterium prodigiosum (serratia marcescens) в-ю л\-1 — продуцент неспецифической эндонуклеазы
11".""""обозна ал
-. италию-, „а;.1
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Со аз Советсннк
Социалистических
Республик (>43I2I4
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61} Зависимое от авт. свидетельства— (22) Заявлено 22.05.72 (21) 1787368/30-15 с присоединением заявки ЛЪ— (32) Приоритет—
Оп оликовано 05.06.74. Бюллетень № 21 (51) М. Кл. С 12k 1/02
Государственный комитет
Совета Мннистров СССР (53) УДК 577.! 5.07 (088.8) по делам изобретений и открытий
Дата опубликования описания 20.06.75 (72) Автор изобретения
3. И. Панфилова (71) Заявитель Институт цитологии и генетики Сиоирского отделения
AH СССР (54) ШТАММ BACTERIUM PRODIG10SUM (SERRATIA
MARCESCENS) В-10 M-1 — ПРОДУЦЕНТ
НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКДЕАЗЫ
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к штамму Bacterium prodigiosum (Serratia marcescens) В-10 М-1 продуценту неспецифической эндонуклеазы.
Известный штамм Bacterium prodigiosum недостаточно активно продуцирует внеклеточную неспецифическую эндонуклеазу (40—
90 ед/мл культуральной жидкости).
Цель изобретения — увеличение активности — достигается тем, что штамм В. ргойgiosum В-10 М-1 получают из исходного музейного штамма В. prodigiosum В-10 под действием нитрозометилмочевины.
Для этого культуру В. prodigiosum В-10 выращивают в среде, содержащей в 1000 мл воды 22 г моногидрата лимонной кислоты, 0,5 г Na>SO4, 5 г КН Р04, 0,8 г MgSO4. 7НаО, 0,04 г NaCI, 0,042 г MgSO< . 4НаО и 10 г глюкозы, при рН 7,0, устанавливаемом с помощью NH OH, до оптической плотности
0,65 (по ФЗК-М со светофильтром № 3).
Культуру охлаждают 1 час, центрифугируют (5000 об/мин, 20 мин), разводят в свежей среде до оптической плотности 0,2, вводят в среду до 0,2о/о нитрозометилмочевины, инкубируют 15 мин, встряхивая на качалках при 30 С. Обработанную мута| сном суспензию высевают в чашки Петри с индикаторной средой, предназначенной для выявления продуцентов эндонуклеазы, содержащей
0,6 мгlмл рибонуклеиновой кислоты (РНК) и 0,01% толуидпна голубого, окрашивающего среду с РНК в голубой цвет. Вокруг колоний, выделяющих эндонуклеазу, через 24 час роста в результате гпдролпза РНК образуется ореол ярко-розового цвета. Отбирают колонии с болыиими по сравнению с контролем зонами РНК-азной активности. Все отобранные варианты проверяют на эндонуклеазную активность прп выращивании на пептонной среде, что позволяет отобрать ряд мутантов, наиболее эффективно продуцирующих эндо-, нуклеазу в среду. Наиболее активным среди нпх оказался мутант М-1, характеризующий15 ся следующими свойствами.
Морфология. Клетки короткие палочки газмером 0,8 — 3 - 0,6 — 0,8 мк; вытянутые, одиночные, парные или в цепочках, подвиж-. ные, грам-отрицательные.
Культуральные признаки и физпологобиохимичсские свойства.
На МПА — колонии округлые, гладкие, блестящие, бесцветные, диаметром 1,5 — 2;0 мм (через 48 час роста при 30 С).
Профиль колоний выпуклый.
На РПА — колонии округлые, бесцветные, с гладкими краями. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Профиль колоний выпуклый.
Желатину разжижает.
431214
Эндопуклеазная активность, ед/мл культуральной жидкости время, час
Штамм
16 23
39 47
26 — 29
69 28 — 79
4I — 88
39 — 79
23 — 77
Известный
489 — 716 230 — 902 j 690 — 1650
1800
850 †15
191 †9
Предлагаемы й
Молоко свертывает, но не пептонпзирует.
Крахмал гидролизует очень слабо.
Клетчатку не разлагает.
Штамм является ауксотрофом, требует добавки в питательную среду серина и лизина.
Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислота не образуется.
Нитраты восстанавливает до нитритов.
Оптимальный режим роста: температура
28 — 30 С, рН среды 6 — 8.
При выращивании на пептонной среде штамм образует до 3600 ед внеклеточной эндонуклеазы на 1 мл культуральной жидкоП р и и е р. Штамм В. prodigiosum В-10
М-1 выращивают на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 24 час, суспендируют в физиологическом растворе до плотности
1 . Ов клеток/мл и инокулируют в 20 мл пептонной среды в количестве 1 10т клеток/мл среды. Инкуоируют в колбах Эрленмейера .на
100 мл в течение 65 — 70 час при 30 С. Через
16, 25, 26 — 29, 39 — 40, 47 и 64 час, отоирают по 05 мл культуральной жидкости и определяют внеклеточную эндонуклеазную активность. Наличие превращения РНК или ДНК е олигонуклеотиды под действием культуральной жидкости определяют по появлению кислоторастворимого материала с абсорбцией при 260 ммк (спектрофотометр СФ-4А, кюветы L = 1 см ). Максимум эндонуклеазной активности наблюдается в интервале
24 — 40 час и достигает 700 — 1800 ед/мл культуральной жидкости. При выращивании мутанта в таких же условиях, но со встряхива нием на качал|ках (160 об/мин) или в колбах
Виноградского в 20 мл среды без встряхивания вследствие улучшенного режима аэрации эндонуклеазная активность возрастает до
3600 ед/мл в период максимального выделения фермента (26 час роста).
При измерении активности фосфомоноэстеразы за единицу активности этого фермента принимают увеличение оптической плотности на 0,1 при 400 ммк за 15 мин инкубации при 37 С. В качестве субстрата испольсти при значительном снижении активности сопутствующей фосфомоноэстеразы.
Штамм устойчив в отношении эндонуклеазной активностн, При его использовании в одинаковых условиях достигается значительно больший выход фермента, чем при использовании известного штамма. Активность фосфодиэстеразы у штамма 10%, а фосфомоноэстеразы 0,13 — 0,36 /о от актиВности ОснОВного фермента. Значительное снижение акTHlBHocTH фосфомоноэстеразы позволяет при промышленном ферментативном гидролизе
РНК-ДНК получить мононуклеотиды; представляющие интерес в производстве АТФ, интерфероногенов и др.
Эффективность предлагаемого штамма
В. prodigiosum В-1О М-1 представлена в таблице. зуют п-нитрофенилфосфат натрия и измеряют светопоглощение на спектрофотометре СФ-4А.
Предмет изобретения
Штамм Bacterium prodigiosum (Serratia
marcescens) В-10 М-I — ародуцент неспецифической эндонуклеазы.
Морфология. Клетки короткие палочки размером 0,8 — 3 . 0,6 — 0,8 мк, вытянутые, одиночные, парные или в цепочках, подвижные, грам-отрицательные.
Культуральные признаки и физиологобиохимические свойства.
На М|ПА — колонии округлые, гладкие, блестящие, бесцветные, диаметром 1,5 — 2,0 мм
35 (через 48 час роста при 30 С). Профиль колоний выпуклый.
На РПА — колонии округлые, бесцветные, с гладкими краями. Поверхность колоний
4о гладкая, блестящая. Профиль колоний выпуклый.
Желатину разжижает.
Молоко свертывает, но не пептонизирует.
Крахмал гидролпзует очень слабо.
Клетчатку не разлагает.
Штамм является ауксотрофом, требует добавки в питательную среду серина и лизина.
431214
Составитель 3, Панфилова
Техред В. Рыбакова
Корректор И. Симкнна
Редактор T. Шарганова
Заказ 223/473 Изд, № 959 Тираж 455 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, 7К-35, Раушская наб,, д, 4/5
Тнп. Харьк. фил. пред. «Патент»
Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислота не образуется.
Нитраты восстанавливает до нитритов.
Оптимальный режим роста: температура
28 — 30 С; рН среды 6 — 8.
При выращивании на пептонной среде штамм образует до 3600 ед внеклеточной эндонуклеазы на 1 мл культуральной жидкости при значительном снижении активности сопутствующей фосфомоноэстер азы.
