Термотолерантный штамм дрожжей @ @ @ @ ,используемый для сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта и способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта
1. Термотолерантный штамм дрожжей Saccharorayces cerevisiae раса ВП (коллекция культур промьшшенных микроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ У-408), используемый для сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта. 2. Способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сьфья с необходимыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию , осахаривание и передачу дрожжевой культуры из сусла концентрацией 17-19% сухих веществ в.головной ферментер батареи с последовательным перемещением непрерьшно-поточным методом и притоком осахаренного сусла, (Л отличающийся тем, что, с целью обеспечения стерильности процесса , ускорения процесса сбражива§ ния путем поддержания постоянным оптимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым yi- леводам, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса ВП, в процессе дрожжегенерации осу ществляют адаптацию этого штамма к со условиям сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренсо ное сусло концентрацией 17-19% сухих веществ с постепенным повьш1ением температуры от 22 до 28с, от 28 до , от 30 до 32 С, при этом карбамид разделяют на две части в соотношении 1:4, большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступенью пересева, а меньшую - на Лаг-фазу процесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла.
СООЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (19) 01) И A
3{5)) С 12 N 15/00; С !2 Р 7/06
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
2. Способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сырья с необходимыми для дрожжей солями — карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры из сусла концентрацией 17-19Х сухих веществ в головной ферментер батареи с последовательным перемещением непрерывно-поточным ме- 1 а тодом и притоком осахаренного сусла, отличающийся тем, что, с целью обеспечения стерильности процесса, ускорения процесса сбраживания путем поддержания постоянным оп- {» тимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым углеводам, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae paca
ВП, в процессе дрожжегенерации осуществляют адаптацию этого штамма к условиям сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренное сусло концентрацией 17-19Х сухих веществ.-с постепенным повышением температуры от 22 до 28 С, от 28 до 30 С, от 30 до 32 С, при этом карбамид раз- фу
0 деляют на две части в соотношении
1:4, большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступенью пересева, а меньшую — на har-фазу процесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла.
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3610659/28-13 (22) 18.05.83 (46) 07. 10.84. Бюл. )l - 37 (72) Б.А. Устинников, Л.А. Воробьева, Т.Ф. Корсакова, Н.С. Сухорукова, С. В. Пыхова, Г. В. Смотрич М, Т. Ясенская, Л.И. Воронова, Е.А. Двадцатова
C.И. Ибрагимова и Н.А. Крамарский (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (53) 663.54(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке ))- 3410974, 18.03.82.
2. Маринченко В.А., Смирнов В.А., Устинников Б.А., и др. Технология спирта. M., "Легкая и пищевая промышленность", 1981, с; 4l6
3. Авторское свидетельство СССР
Ф 566872, кл. С 12 С 11/08, 1976.
4. Регламент производства спирта иэ крахмалистого сырья. Часть 1. М., Минпищепром СССР, Всесоюзный научноисследовательский институт продуктов брожения, 1979, с. 81-85. (54) ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫЙ lilTAMM ДРОЖЖЕЙ
SACCHAR0MYCES CEREVISIAE РАСА ВП, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СБРАЖИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ
ЭТИЛОВОГО СПИРТА, И СПОСОБ СБРАЖИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ЭТИЛОВОГО СПИРТА. (57) 1. Термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae paca
ВП (коллекция культур промышленных микроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ У-408), используемый для сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта.
1 1117319 3
Изобретение относится к спиртовой промьппленности и представляет собой термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса ВП для сбраживания крахмалсодержащего сырья в спиртовой отрасли и способ сбраживания крахмалсодержащего сырья.
Известен термотолерантный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae paca
К-81, используемый для обслуживания 10 крахмалсодержащего сырья при производстве спирта (1), Недостатком этого штамма является его неспособность сбраживать высококонцентрированное сусло (17-19 СВ). 15
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является штамм Saccharomyces cerevisiae paca
ХП, сбраживающий высококонцентрированное сусло (2) .
Недостатком известного штамма яв" ляется то, что он не термотолерантО ныл и уже при температуре выше 32. С происходит автолиз, что ведет к инфицированию среды посторонними микро-2 организмами и к потерям спирта.
Известны способы сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающие введение дрожжей и сбраживание зерно-кар- 30, тофельного сусла непрерывно-поточным методом (3) .
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является способ сбраживания крахмалсодержащего 35 сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды лутем смешивания крахмалсодержащего сырья с необходи- 40 мыми для дрожжей солями — карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры и сусла концентрацией 1719 СВ в головной ферментер батареи с последовательным перемещением непрерывно-поточным методом и притоком осахаренного сусла (4) .
Недостатком известного способа является то, что процесс брожения 50 протекает лри температуре не вьппе
30 С, при повышении же температуры происходит значительный автолиз дрокжевых клеток и инфицирование среды.
Так как нарушается в процессе броже- 55 ния оптимальное сбалансированное пи" тание по азоту и углеводам, дрожжи теряют свою активность, что в сочетании с инфицированием среды приводит к значительным потерям в выходе спирта. Уже после 48 ч сбраживания нет резервов для удлинения процесса и получения дополнительного выхода спирта. Наступает инфицирование среды и потеря дрожжами бродильной ак-. тивности.
Целью изобретения является получение термотолерантного штамма дрожжей, .способного сбраживать высококонцентрированное сусло при повьппенных температурах, обеспечение стерильности процесса, ускорение процесса сбраживания путем подцержания постоянным оптимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым углеводам.
Предлагаемый штамм вьщелен из производственных дрожжей и адаптирован к высоким концентрациям сухих веществ в сусле °
Селекция проводилась в два этапа, Первый этап заключался в вьщелении расы дрожжей из производства, способной сбраживать сырье лри повьппенной температуре (34-36 С). Для этого прио меняемая на заводе культура дрожжей рассеивалась в виде колоний на суслоагар и выращивалась при 34-36 С. Коо лонии, отличающиеся от исходной расы дрожжей, проверялись на способность сбраживать углеводы.
На втором этапе селекции был применен метод адаптации термотолерантной расы к высоким концентрациям сухих веществ. Путем еженедельного пересева термотолерантной расы из среды с повышенной концентрацией сухих веществ и рассева дрожжей в виде колоний на сусло-агар была отобрана раса, отличительной чертой которой была способность при 34-36 С сбражио вать сусло с высокой концентрацией сухих веществ (до 20 ).
Штамм хранится в коллекции музея культур промышленных микроорганизмов
Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции, коллекционный номер У-408, Предлагаемый штамм дрожжей
Saccharomyces cerevisiae раса ВП имеет следующие морфологические и культуральные признаки.
Морфологические признаки, Дрожжевые клетки овальной или яйцевидной формы. Размер клеток 7,5х5,9 мкм;
Размножение почкованием. Форма дрож»17319 ф жевых клеток выращенных на суслоУ
О агаре в течение 26-28 ч при 32-34 С, яйцевидная, овальная, редко встречаются клетки вытянутой формы.
Гигантская колония 10-суточной
Ф t
Отношение к источникам азота. Хорошо ассимилирует мочевину, пептон, дрожжевой автолизат, азотнокислый и хлористый аммоний, азотнокислый ка- 4О лий, кальций, натрий.
Не потребляет сернокислый аммоний.
Факультативный анаэроб.
Для достижения поставленной цели по способу сбраживания крахмалсодер- <5 жащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающему приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сырья с не- 50 обходимыми для дрожжей солями — карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры и сусла концентрацией 17-19 сухих веществ в голов- 55 нои ферментер батареи с последовательным перемещением непрерывно-поточным методом и притоком осахаренного сускультуры на сусло-агаре.
Форма колонии: круглая.
Размер колонии: 26-28 мм в диаметре.
Характер края: крупнолопастной с радиальной исчерченностью 10
Поверхность: тусклая. ,В центре колонии выпуклый валик неправильной формы с морщинистой поверхностью.
Цвет колонии: белый с кремоватой серединой.
Профиль колонии: в центре выпуклый.
Штрих на сусло-агаре.
Рост: мощный, плотный.
Характер края: мелкофестончатый.
Профиль: выпукльп .
Цвет. штриха — тусклобелый.
Рост по уходу в сусло-агар.
Рост по длине укола, утолщающийся
-кверху. 25
Форма укола: бугристая.
Разжижения не наблюдается.
Питательная среда пронизана пузырьками газа.
Физиологические признаки. gg
Оптимум температуры роста 34/36 С.
Отношение к источникам углерода.
Усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу. Слабо ассимилирует ксилозу, арабинозу. Не усваивает крахмал декстрины мелибиозу. ла, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штамм дрожжей Saccharomykes cerevisiae раса ВП, а в процессе дрожжегенерации осуществляют адаптацию этого штамма к усло-. виям сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренное сусло концентрацией 17-19% сухих веществ с постепенным повьппением температуры от 22 до 28 С, от 28 до 30 С и от
30 до 32 С, при этом карбамид раздеО ляют на две части в соотношении 1:4, большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступенью пересева, а меньшую - на лаг-фазу процесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла.
Предлагаемьп способ осуществляется следующим. способом.
Культуру Saccharomyces cerevisiae раса ВП выращивают на сусло-агаре в пробирках, хранят культуру, затем пересевают на свежую питательную среду — сусло-агар.
Затем осуществляют разведение чистой культуры путем ее последовательного пересева.
Полученные засевные дрожжи адап» тируют к повьппенной температуре сбраживания, осуществляя последовательный пересев в три ступени на осахаренное высококонцентрированное сусло с постепенным повышением температуры от
22 до ?8 С, от 28 до 30 С и от 30 до 32 С.
Карбамид разделяют на две части в соотношении 1:4 и вводят соответственно в осахаренное сусло перед первой ступенью адаптации и на лагфазу в процессе брожения совместно с притоком дрожжей и осахаренного сусла.
Соотношение усвояемого азота к сбраживаемым углеводам на протяжении всего процесса брожения поддерживают равным 1:200.
Брожение ведут непрерывно-поточным методом.
Ф
Пример 1. Культуру Sacch.
cerevisiae раса ВП выращивают на сусло-агаре с содержанием 7Х СВ в пробирках при 32 С в течение 24 ч. о
Хранят культуру при 6 С в течение а
1,5 мес. По истечении указанного срока для сохранения бродильной активности культуру пересеивают на свежую питательную среду — сусло-агар.
11173
Затем осуществляют разведение .чистой культуры путем последовательного пересева из пробирки с культурой. в колбу, содержащую 0 5 л стерильного сусла. Сусло приготавливается из измельченного солода (на i кг солода расходуется О,? л воды), осахаривается при 58 С в течение 2 ч. Концентрация его должна составлять 120 по сахарометру. 10
Колбу с суслом и дрожжами помещают в термостат при 30 С. Через 20 ч бродящее дрожжевое сусло переливают в бутыль с 5 л стерильного такого же сусла, подкисленного до 0,80Д. Бутыль 15 с суслом помещают в термостат 30 С о при отброде, равном 50 по сахарометру, перс.лпвают содержимое в маточник с 5 дал сусла концентрацией 10 по сахарометру, подкисленное до 0,8 . 20
Для разведения дрожжей в маточнике Iic!!;»I»зуют нефильтрованное сусло, прнготовле следующим образом.
Для приготовления 1 дал дрожжевого с.уела расходуется 1,3 кг ржаной муки и 1,9 кг измельченного зеленого солода. Муку смешивают с водой при
30 С. Смесь выдерживают при 90 С о о о в течение часа, расхолаживают до 60.С, после с го заливается дробленый со- 30 лод. Осахаривание продолжается 1 ч при 58 С и 1,5 ч при 65 С. Затем сусо ло выдерживается при 80 С в течение о
30 мин, охлаждается до 50 С и подкисляется до 0,75 серной кислотой.
Засевные дрожжи из бутыли в маточО нпк задаются в объеме 10Х при 30 С, Из маточника дрожжи передают для
IIoследующего размножения в дрожжанки.
Характеристика зрелых дрожжей пред-40 ставлена в табл. 1, динамика накопления дрохокевых клеток — в табл. 2.
Пример 2. Полученные по примеру 1 засевные дрожжи адаптируют к повышенной температуре сбражива-45 ния, осуществляя пересев в три ступени на сусло, приготовленное из измельченной пшеницы. Для получения сусла пшеницу измельчают, смешивают с водой в соотношении i:2,8 до концентрации 181 СВ, осахаривают смесью солодов в течение 2 ч.
В осахаренное сусло задают диаммошшфосфат в количестве 150 г и карба5S мид в количестве 560 г на 1 м /сусла,5 перемешивают, пастеризуют в течение о
20 пи при 80 С, подкисляют до рН
:3,6- 3,8, охлаждают до температуры
19 Ь
1-й стадии адаптации 22оС, засевают на эту среду дрожжи в количестве 10i к объему осахаренного сусла и сбраживают в течение 18 ч, поддерживая о температуру брожения до 28 С. Затем вновь аналогичным образом готовят сусло, вводят дрожжи в количестве
10Х к объему сусла и сбраживают в течение 16 ч, поддерживая температуру
28-30 С (за счет тепла, выделяемого при сбраживании). Аналогично осуществляют 3-ю стадию адаптации в течение
16 ч, поддерживая температуру 30-32 С. о
Отношение азота к углеводам устанавливают оптимальным для дрожжей, равным 1:200, при введении карбамида на стадии дрожжегенерации.
С 3-ей стадии адаптированные к производственным условиям дрожжи пересевают в три дрожжанки на сусло, приготовленное указанным способом.
Через 1ч ч сбраживания производственные дрожжи из 3-х дрожжанок передают в головной ферментер батареи.
Сбраживание осуществляют в ферментере емкостью 100 м при скорости притока сусла 12 м в час и подачи дрож" жей — 30 м совместно с карбамидом, который задают в количестве 140 r на 1 м сусла для поддержания соотношения азота к сбраживаемым углеводам равным, как уже доказывалось, 1:200.
Температура подаваемого сусла на брожение 30 С. Брожение ведут непрерыво но-поточным методом в течение 60 ч при температуре на стадии главного брожения до 38 С. Выход спирта равен
65,5 дал из 1 т крахмала.
Технологические показатели зрелой бражки представлены в табл. 3.
Осуществление процесса достигается использованием термотолерантного штам-* ма дрожжей и введением карбамида в два приема — на стадии дрожжегенерации и в начальной стадии процесса брожения, I
При использовании термотолерантного штамма сохраняется жизнедеятельность дрожжей при высоких температурах. B этом случае не происходит значительный автолиз дрожжевых клеток, сохраняется их бродильная активность и тем самым ингибируется развитие посторонней микрофлоры.
Этот эффект, направленный на сохранение жизнедеятельности и высокой активности дрожжей, еще более усиливается введением и поддержанием сба1! 173
Т а б л и ц а 1
Контроль
Время созревания дрожжевых клеток, ч
Процент мертвых клеток
Процент почкующихся клеток
Количество клеток, мпн/мл
Температура брожения, ОС
Температура складки, ОС
Начальная концентрация дрожжевого сусла, 7
11,0 0,0
173
27
18,8
19,6
0,8
159
26
17,4
166
28,5 0,4
27
18, 1
Ередние результаты
19,7 0,4
16S
24
18, I лансированного питания по азоту и углеводам. Азот необходим для создания ,белков, дрожжевой клетки, включая структурные белки, входящие в состав оболочки клетки, оболочки спор, и структурные элементы внутренних частиц клетки, и для создания всей ферментной системы клетки.
Углеводы необходимы для дыхания клетки, биосинтеэа белков в тех слу- 1О чаях, когда нет необходимых аминокислот.
Из карбамида дрожжей образуют один из необходимых для их развития витаминов — биотин. 15
Максимально возможная скорость размножения дрожжей достигается лишь при обязательной и строгой сбалансированности процессов анаболизма и катаболиэма. Скорость размножения дрожжей на 2О богатых питательных средах в значительной степени зависит от сбалансированного источника питания.
Внутриклеточная концентрация азо: тистых и углеводных соединений возрас- 25 тает в лаг-период весьма существенно, поэтому важно ввести источник азота именно в две фазы на стадии активно. го размножения дрожжей и в период лаг-фазы, когда молодые клетки уже потребили часть питательных веществ и его надо восполнить, чтобы соотноI
19 8 шение азота к углеводу было постоянным и равным 1:200.
После лаг-фазы жизнедеятельность дрожжей протекает в постоянных установившихся условиях, начинается процесс биосинтеза спирта и это соотношение уже остается постоянным.
Если давать карбамид лишь на стаФ дии дрожжегенерации, то. это привЕдет к увеличению в среде источника азота и энергии при отсутствии сбалансированности по углеводу, что отрицательно влияет на физиологическое состояние клетки. Оптимальным является соотношение 1:200, так как выше или ниже этих пределов неиспользованная на процессы размножения клеток энергия рассеивается в виде тепла и аккумулируется в запасных и недоокисленных продуктах метаболизма.
Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с известным представлены в табл. 4.
Таким образом, предлагаемые штамм и способ позволяют сбраживать высококонцентрированное сусло при повышенных температурах, обеспечить стерильность процесса, ускорить процесс сбраживания путем поддержания постоянным соотношения азота к сбраживаемым углеводам.
1117319
Продолжение табл, 1
Время созревания дрожжевых клеток,ч
42,6
0,0
28
18,4
37,5
0,9
110
30
0,6
71,7
14
17,8
28
Средние результаты
0,6
50,6
113
28
17,9
Т а блица 2
Опыт
Контроль .
Процент почкующихся клеток
Продол- Общее житель- колиДрож- Продол- Общее жанка житель- колиПроцент мертвых клеток
Процент мертвых клеток
Процент почкующихся клеток
Дрожжанка ность чествыращивания выращивания, ч дрожжевых во дрожжевых клеток млн/мл клеток, млн/мл
39 63 0
61,7
74,0
70 57., 0
90 55,1
108 57,5
112 58,9
125 70,0
127 75,0
52 54,5
60 5 34,7
63,5 35 1
88,0 37,5
122,0 42,6 - 0,1
10
14
16
64,3
137
37,2
151
173
Начальная концентрация дрожжевого сусла, Е
Температура складки, ОС
Температура брожения, ас
12,7 0,4
Количество клеток, млн/мл ность чество
Процент Процент почку- мертвых ющихся клеток клеток
1117319 и
I"
O tt !
0. е л
Ch 00 ф 00 б в б в
«0 «О «00 IO
Ch «h б б
C) «0
00 а Ch
° б б
«О ао 00 ь б ь л а
О О в в о о
Ъ
О о
»с
Гч о - е
Ch Ch O
«Ч - «Ч N в в в б о ь о о л
О сч в о
° ° в в б о
Ре ф !
aIl
О !!! х
kf й
) М\ а в
D о о о ь !
CO
° Ф ! Фб! в ь о
СЧ
) в о
В (v
all
О «О кй M
A б б о ь ь а
РЪ ь
«б3
С Ъ в ь
Сб\
Ф»Ъ б о
Ъ« х !
«
° О б ь
I л о ь ь л в о! в
I! I
I аЛ О л Ct в б в
C0 CXI «0 а б
Ю л б
00 «О ао
З,е ф
Ц о
3.
В 3!
P go
«h ° л! о б в в о о о
«Ч
° - I ф а
an ф с Ъ б о
° Ф в о
t4 О «Ч
С Ъ »Ъ
f4 «Ч <» в б в о о ь а an иЪ . C»I Ф Ъ РЪ в ° б
О D O
Ъ!Ъ Л аб а а л»! сч а МЪ Л в в в в о о о о
O з
Ф
CV О В
° Ф 4бЪ 4 Ъ
o o
an, ° Ъ- » в о!
Ъ П !Ъ Ф »t
o o o
4б\ в
° ч
Ф Ъ о
Cn Ya» In
Т Т в е е в о в
«Ъ Е Ъ!Ъ e. .Л В Е О
1 «Ч 00 «!
6» СбЪ Ф ь о о! х ! ц л ЪО О е
3. ь" о у ам! в . о л л ь
ev I 2
0 к
t4 »1 ф ь е0 0 а х î е х
11173 19
Таблица 4
Стерильность процесса
Способ сбраживания
Время ебраживания, ч
Выход спирта
48 ч 64, 7 дал/т крахмала
Предлагаемый
Процесс протекает в стерильных условиях при 38 С, так как исо пользуется термотолерантный штамм, исключающий процесс автолиза, поддерживая оптимальное соотношение азота к углеводу благодаря двухступенчатой задаче карбамида.ч
60 ч 65,5 дал/т крахмала
48 ч 64,7 дал/т крахмала
Известный
Процесс протекает при температуре не выше 30 С. Повышение температуры приводит к инфицированию, так как дрожжи не термотолерантны и подвергаются автолизу
Составитель Л. Пашинина
Редактор Н. Егорова Техред А.Бабинец Корректор А. Обручар
Заказ 7152/17 Тираж 521 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4
П р и м е ч а н и е. Дальнейшее увеличение времени сбраживания невозможно, так как идет нарастание кислотности и потеря спирта. Нет резервов для увеличения выхода.
