Способ определения госсипола в биологических материалах

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОССИПОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ, включающий экстракцию свободного гсссипола из анализируемой пробы, отделение твердой фазы, гидролиз ее в присутствии анилина для выделения связанного госсипола, последующую очистку экстракта и гидролизата последовательной обработкой растворителя и идентификацию госсипола в полученных фракциях экстракта и гидролизата по цветной реакции с хлорным железом, отличающийся тем, что, с целью повьшения чувствительности способа, перед идентификацией госсипола полученные фракции подвергают дополнительной очистке хроматографированием в тонком слое силикагеля. 2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что при использовании в качестве биологических материалов хлопковых семян, жмыха, шротов и комбикормов дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из экстракта, осуществляют в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении lOtl:8+1:8±. 3.Способ по п.1, отличающий с я тем, что при использовании в качестве биологических материалов тканей животных дополнительную очистку хроматографированием фракций, по3 лученных из экстрактов, осуществляют в две стадии, причем первую стадию проводят.в присутствии смеси растворителей , содержащей петролейный эфир, толуол, ацетон и хлороформ в соотношении lOi :2±1:4±1;4±1, а вторую - в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении 10+1:8+1 8tl. 4.Способ по п.1, отличаюю щий с я тем, что дополнительную Од очистку хроматографированием фракций, 00 1C полученных из гидролизата, осуществляют в присутствии смеси растворителей , содержащей петролейный эфир и ацетон в соотношении 15±1:10+1.

СОЮЗ CQBETCHHX

СО@4АЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК зЮ ао1Н31О8

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЬПИЙ (21) 3606484/30-15 (22) 13.Р6.83 (46) 30,!1,84. Бюл. Ф 44 (72) И,Г.Юдина (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, (53) 543.544(088.8) (56) 1, ГОСТ 13979 11-69.

2. Smith F., J. Aoos, 1965, 42, 145-147. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОССИПОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ, включающий экстракцию свободного госсипола из анализируемой пробы, отделение твердой фазы, гидролиз ее в присутствии анилина для выделения связанного госсипола, последующую очистку экстракта и гидролизата последовательной обработкой растворителя и идентификацию госсипола в полученных фракциях экстракта и гидролизата по цветной реакции с хлорным железом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, перед идентификацией госсипола полученные фракции подвергают дополнительной очистке хроматографированием в тонком слое силикагеля, ÄSUÄÄ 112 А

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что при использовании в качестве биологических материалов хлопковых семян, жмыха, шротов и комбикормов дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из экстракта, осуществляют в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении 10+1:8+1:8+1.

3. Способ по п.l, о т л и ч а ю— шийся тем, что при использовании в качестве биологических материалов тканей животных дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из экстрактов, осуществляют 19 в две стадии, причем первую стадию проводят::в присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир, толуол, ацетон и хлороформ в соотношении 1021:2+1:4+1:4+1, а вторую — в Я присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении 10+1:8+1:8+1..

4, Способ по п.l, о т л и ч а ю— шийся тем, что дополнительную Ю очистку хроматографированием фракций, ©) полученных из гидролизата, осуществ- Я) ляют в присутствии смеси растворите- «1 лей, содержащей петролейный эфир и фф ацетон в соотношении 1511:10+1.

1 11768

Изобретение Относится к.способам опрсделения госсипола (2,2-ди-1,6,7-"

-триакси-5-изапропил-8-альдегидокафтил j в семенах хлопка, его жжтхах, шратах, а также комбикормах и тканях животных для контроля за ега садержанием прн производстве кормов и

rIpH диагностике токсикозов„

Известен способ определения гоcñHпола в хлопковых семенах, жмыхе и I0 шротах., включающий экстракцию свободного госсипала диэтиловым эфиром,. концентрацию экстракта, реакцию госси-. .пала с акилином и пиридинам к поспз,ггугсгг,ee определение eãî количества ве- «;. совым методам. Связанный госсипол определяют после экстракции свободного в той же пробе путем гидролиза

В присутствии анилин а и по следующе го взвешивания госсипала 11 1.

Известен такке способ определения госсипала Б органах и тканях животных, включающий извлечение "вабад--IOI"О госсипола органическими растворителями, реакцито с аниликом после последа- gq вательной обработки экстракта растворителями и последующее определение госсилала Iro цветной реакции,, Опре.деление связаннага госсипола проводят путем гидрализа его в присутртвии анилина после извлечения свободнога госсипола в той же навеске и после. дующей экстракции связанного гассипо-ла гексанам (2 ).

Однако известные способы апределе т, ния госсипола недостаточно чувствительны.

Цель изобретения — повышение чувст вительности способа определения Iocсипала.

Поставленная цель достигается тем, чта согласно способу определения гассипола в биалотических материалах, включающему экстракцию свободного гассипола из анализируемой пробы, от15 деление твердой фазы, гидролиз ее В присутствии акилина для выделения связанного госсипола, последующую очистку экстракта и гидролизата последовательной обработкой растворителями и идентификацию госсипола В палученньгх фракциях экстракта и гидрализата по цветной реакции с хлорным железам перед идентификацией го с си

« пола полученные фракции подвергают дополнительной очистке путем храматоГРафИРОВаНИЯ.Б тОНКаМ СЛОЕ СИЛтиКаГЕля.

72

При использовании в качестве биологических материалов хлопковых семяк. жмыха, шротов к комбикормов дополнительную очистку храматографированием. фракций, полученных из экстракта, Осушествлтпот в присутствии OMeси растворителей, содержащей уксуснуто кислоту, толуол и гексан в соотношении 10+1;8 1;8+1„

При использовании В качестве биологических материалов тканей животных дополнительную очистку храматографираванием фракций, полученных из экстрактов. осуществляют В две стадии,, причем первуто с-:адию ipoBQ дят в присутствии смеси растворителей содержащей петролейный эфир, талуол, ацетон и хлороформ Б соотношении 10+1:?+ ::.4+1:4+1, а вторую — в при сут ст вии сме ск растворителей, садержащеи уксусную кислоту,, талуал и

-=-ксан в соотношении 10+1:8+1:8+1, Дополнктельнуто Очистку храматаграфИРОВаНИ«М фРаКЦИйт ПОЛУЧЕННЫХ.К3

ГИЦРОЛИЗата, О СУЩЕ СттЗЛЯЮТ В IIРИСУтСтвии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир и ацетон в саотнак т5-,;10+1, П р и тт e p 1, Спре,.:.:еле .ие гассипала в хлопковых семенах, шротах„ жмыхе к комбикормах.

A. Массу исследуемого Образна измельчают на мельнице да парашкаабразного состояния, тщательна перемешивают и Отбирают среднюю пробу семян, шрата, жжт»а. 2-3 г, комбикормов 5 г.

Образцы помещают в колбу объемом

250 мл,. дабавлятот 50 мл смеси ацтетона H зоцы (7: 3 1 и 5-6:теклянных бусинок, Паоле "0 мин перемешивания экстракт прафильтровывают через бумажньй озильтр,. колбу три раза прож)Бают тай же смесью, Фильтрат и смывы тОМ«ЕщаЮТ В ДЕЛИТЕЛЬНуЮ ВОраНКу р ВНО сят туда 10 мл . петралейнаго эфира и тщательно перемешивают «После разделения cJIOFH нижний, содержащий гассиПОл, сливают В другую делительную воронку, а верхний слой эфира отбрасьтвают. Обработку петралейный эфиром повторяют,. после чего В воронку вноcRT 100 мп дистиллирОваннОИ ВОды и

1 4л кОнцентрирОВаннОЙ сОлянай кисла ты, перемешивают и гравоцят Обработку экстракта хлороформам. Хлороформ добавляют порциями 5-6 раз по 5 мл, Объединенные хларофарта;ые экстракты

Объединяют и Вьт1таривают,qocyxa В тО ке воздуха. Сухие Остатки нз проб

1126872 семян, жмыха и шротов растворяют в

10 мл, а из пробы комбикорма в 2 мл ацетона.

Полученные фракции экстракта наносят на пластину "Силуфол" (1020 мкл экстракта из образцов семян, жмыха и шротов и 50 мкл экстракта из образцов комбикорма ). Хроматографирование проводят в присутствии хроматографической смеси: ледяная уксус- IO ная кислота - толуол — гексан в соотношении 11:9:9 или 9 7:7. После того, как фронт растворителей проходит 10 см. пластину вынимают из камеры, просушивают и опрыскивают 15

57-ным раствором хлорного железа в

507-ном этаноле. Bf госсипола составил в первом случае 0,8, во втором

0,85;. пятна округлые, оливко-серого цвета на желтом фоне. 20

Б. Для освобождения связанного госсипола в колбы с остатками материала после извлечения свободного госсипола (твердая фаза ) добавляют 10 мл ацетона в пробы семян, жмыха и шротов 2S или 10 мл 72%-ного этилового спирта в пробы комбикорма и 1 мл свежеперегнанного анилина. Колбы закрывают и помещают на 30 мин в водяную баню (температура 60-70 С ), после че го охлаждают. К полученным гидролизатам добавляют 50 мл гексана, выдерживают при встряхивании 30 мин, а затем гексановые фракции гидролизатов в делительных воронках 5-6 раз по 5 мл

35 промывают 0,2н. раствором соляной кислоты. После разделения слоев гексановые фракции гидролизатов высушивают досуха в токе воздуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл (пробы из 40 семян, жмыха и шротов ) или в 2 мл ацетона (пробы из комбикормов ) и наносят на пластины "Силуфол" по 20 или 50мкл соответственно, параллельно наносят стандартный раствор дианилингоссипола.4 Хроматографирование проводили в при сутствии смеси растворителей: петролейный эфир — ацетон в соотношении

14:9 или 16: 11.

После того, как фронт растворителей проходит 10 см, .пластины подсушивают и проявляют 57.-ным раствором хлорного железа в 507-ном этаноле.

Пятна округлые, коричневого цвета. 55

Rf впервом случае 0,6,во втором 0,55., Пример 2, Определение госси-1 пола в образцах мышц, почек, печени.

А, К 5 г тщательно измельченных кусочков тканей, помещенных в колбы объемом 250 мл, добавляют 50 мл ацетона, После 30-минутного встряхивания пробы профильтровывают в делительные воронки, к фильтрач ам .добавляют примерно равный объем петролейного эфира и 10 мл 1Х-.ного раствора буры. После повторной обработки слоя эфира 10 мл раствора буры его отбрасывают, в делительную воронку вносят

100 мл дистиллированнои воды и 1 мл концентрированной соляной кислоты, а затем проводят обработку экстракта хло6офоомом. Хпооофоом добавляют порииями три раза по 5 мл при интенсивном встряхивании. Хлороформные фракции госсипола объединяют и выпаривают в токе воздуха.

Полученные сухие остатки растворяют в 1 мл ацетона, По 100 чкл ацетоновых фракций госсипола наносят на пластины"Силуфол . Хроматографирование Фракиий экстракта проводят в присутствии системы растворителей: петролейный эфир — толуол — ацетон— хлороформ в соотношении 9:1:3:3 или

10:2:4:4 или 11:3:5 5, причем, когда фронт растворителей доходит до противоположного края пластины, ее вынимают, подсушивают и помещают в камеру с хроматографической смесью, состояшей из ледяной уксусной кисло ты — толуола — гексана в соотношении

10:8:8, Когда фронт растворителей проходит 10 см, пластину вынимают, подсушивают и опрыскивают хлорным железом. Rf 0,8-0,85, пятна узкие, оливко-серого цвета на желтом фоне, Б. Гидролиз остатков образцов тканей твердая фаза) для определения связанного госсинола проводят также, как в примере 1, После нанесения ацетонового раствора фракций гидролизата на пластину ее помещают в камеру с хроматографической смесью: петролейный эфир — ацетон в соотношении 15:10. Rf 0,6-0,55, пятна узкие, коричневого цвета на желтом фоне.

Чувствительность предложенного способа определения госсипола для определения свободного госсипола в кормах составляет 0,15 мг/кг, в тканях животных 0,02-0,05 мг/кг, связанного во всех субстратах 0,05 мг/кг.

Абсолютная чувствительность обнару,жения стандартного вещества в тонком слое силикагеля составляет: свободТаблица 1

Обнаружено, Е

Внесено в пробу, мкг

Ис следуе мый объект

Иэвестныи способ

Предложенный способ

Свободный

Связан" HhlH

Свободный

Связанный

1. Хлопковый шрот

0,18

Без добавки 0,02

0,02

0,022

0„23

0,03

0 032

0,О32

0,25

О, 16

О, 23

0,02+0,0008 0,14+0,02 0,031+0,0 0,24+0

2. Хлопковый шрот

О, 025

О, 025

0,025

0,025

0,21

0,2

0,1

0,2

0 Îl23

0,0123k

0,00004

0,12+

0i01

0,220,0

3.Хлопковы" шрот

0,0123

Не ис- 0,03 следовалось

100

Не иссле довало сь

0,06

0,0124

0,0123

750

1000

0,075

Обнаружено, мкг

Количество внесенного Гос снпола,мкг

Исследуемый субстрат

НавесСвобод- Связанный ный

Свободный

Связ анный ка, г

7,0

l0

Мышцы

Мышцы

30

Э 112687 ный госсипол 0,03-0 01 мкг, связанный О, 1 мкг. Степень определения свободного госсипола составляет 70-80Х, связанного 100Х.

Более высокая чувствительность 5 предложенного способа определения госсипола в хлопковых шротах.no .. сравнению с известным способом (ГОСТ 13979. 11-69 ) показана в табл. 1 (определение госсипола в хлопковых 10 шротах ).

В табл. 2 представлены результаты определения госсипола в тканях животных согласно предложенному способу, 15

Без добавки 0,0124. 0,0123

Т аким образом, предложе нный способ определения госсипола обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать его в любых субстратах и в самых небольших количествах, а зто, в свою очередь, позволяет гарантировать профилактику токсикозов, вызванных госсиполом.

Кроме того, предложенный способ определения госсипола прост в исполнении, для проведения анализа не требуется сложное оборудование, а время проведения анализа по сравнению с известным способом значительно сокращается.

I Таблица 2

Степень определения,X

1126872

Продолжение табл.3 наружено,мкг Степень определения,X

Количество внесенИсследуе субстрат авесобо

Связан Свобод- Связанный ный ный

a,ã ного госсипола,мкг

110

100

200

I При данных количествах свободный госснпол не определяли, а исследовали его, как связанный госсипол.

Составитель P. Куриленко

Редактор С. Тимохина Техред Л.Коцюбняк Корректор В. ярняк

Заказ 8684/33 Тираж 822 Подписное

ВНИИИИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Печень

Печень

Мышцы

Почки

200

5 7,0

5 25,6

86