Способ иммобилизации микросом печени

 

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем их ковалентного связывания на полиэтилене с привитык сополимером с помощью поперечносшивающего реагента, отличающийся тем, что, с целью повышения монооксигеназной активности целевого продукта и удешевления способа , в качестве привитого сополимера используют полиаллиловый спирт в количестве 4-9%, а в качестве поперечно-сшиваящего реагента 15-35%-ный п-бензохинон, причем массовое соотношение белка микросом и носителя составляет

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) () 1) 4(si) С 12 N 11 18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

H ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3642160/28-13

{22) 28.07.83 (46) 15.06.85. Бюл. У 22 (72} Т.И. Давиденко, О.В. Севастьянов, А.Д. Помогайло и С.А. Андронати (71) Физико+химический .институт

AH УССР (53) 517. 15 (088.8) (56) 1 ° Патент ГКР Ф 113013, кл. С 07 С 7/02, 1975.

2. Авторское свидетельство. СССР

В 1057536, кл. С 12 N 11/18,, 1981. (54) (57) СПОСОБ ИИИОБИПИЗАЦИИ ИИКРОСОИ ПЕЧЕНИ путем их ковалентного связывания на.полиэтилене с привитым сополимером с помощью поперечносшивающего реагента, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью новьппения монооксигеказной активности целевого продукта и удешевления способа, в качестве привитого сополимера используют полиаллиловый спирт в количестве 4-93 а.в качестве поперечно-сшивающего реагента—

15-35Х-ный п-бензохинон, причем массовое соотношение белка микросом и носителя составляет (0,3:10)(1: 10) .

161553 2

10

Цель изобретения — повышение монооксигеназной активности целевого продукта и удешевление способа получения иммобилизованных микросом.

Поставленная цель достигаешься тем, что согласно способу иммобилизации микросом печени путем их ковалентного связывания на полиэтилене с привитьик сополимером с помощью поперечно-сшивающего реагеита, в качестве привитого сополимера исполь

1,1

Изобретение относится к биотех-,.: нологии, в частности к способам получения иммобилизованных микро. сом печени животных, и может быть применено в медицине и биохимии для изучения метаболизма и ток, сического действия лекарственных веществ, в аналитической промышлен1 ности (для создания ферментных элементов) в тонком органическом синтезе (для направленного получения продуктов окисления, обладающих оптическай активностью).

Известен способ иммобилизации микросом печени, заключающийся в ковалентном связывании с матрицей

BrCN-активированной сефароэой j1) .

Недостатками данного способа являются необходимость разделения монооксигеназной системы микросом печени на компоненты: цитохром

P-45О, НАДФН-зависимую редуктазу и фосфатидилхолин перед иммобилизацией для получения стабильного продукта, обладающего активностью, так как при иммобилизации самой системы микросом наблюдается полное исчезновение монооксигеназной активности, низкая активность и стабильность целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ иммобилизации микросом печени путем их ковалентного связывания на полиэтилене с привитым сополимером с помощью попвречно-сшивающего реагента, в качестве привитого сополимера используют полиакриловую кислоту в количестве 6-10, а s качестве поперечно-сшивающего реагента карбодиимид f2) °

Недостатками способа является низкая активность монооксигеиаэы у целевого продукта (25X от исходной). а также необходимость использования дорогостоящего карбодиимида.

3$

4$

$0

$$ зуют полиаллиловый спирт в количест-. ве 4-9, а в качестве поперечно-сшивающего реагента 15-35 -ный и-бензохинон,причем массовое соотношение белок микросом и носителя составляет (О 3.10)-(1 10)

Сущность способа заключается в использовании полиаллилового спирта в количестве 4-9% в качестве привитого сополимера и 15-55%-ный и-бензохинона в качестве поперечно-сшивающего реагента. Преимущества при этом возникают как за счет изменения структуры полимера, так и вследствие увеличения расстояния от микросом до матрицы при замене карбодиимида на бензохинон. Важным параметром при этом является соотношение белок микросом: носитель, которое должно быть в диапазоне от (0,3:10) †(1:10). Ионооксигеназная активность в указанном интервале соотношений максимальна (таблица 1), при соотношении 1,25: 10 значение активности также несущественно изменяется, однако при этом резко падает процент связывания белка микросом. При весовом соотношении

0,2:10 монооксигеназная активность составляет 70%. В таблице приведены также возможные интервалы параметров, касающихся концентрации и-бензохинона и полиаллилового спирта.

Оптимальное значение количества привитого полиаллилового спирта составляет 4-9%. При использовании носителя с 2 полиаллилового спирта монооксигеназная активность составляет

58-59 от максимальной, верхний предел {9 ) полиаллилового спирта обусловлен воэможностями метода радиационной прививки. Использование низких концентраций и-бензохннона приводит к снижению активности препарата, а era увеличение свыше 35 нецелесообразно.

Способ позволяет полностью сохранить монооксигеназную активность целевого продукта и удешевить процесс за счет использования доступного поперечно-сшивающего реагента.

Пример 1. Активация полиэтилена с 5,6Х привитого полиаллилового спирта осуществляется следующим образом. К 9,0 r полиэтилена с 5,6 привитого полиаллилового спирта в 560 мл О,i И KH PO /NaOH буфера, рН 8,0 (комнатная температура, перемешивание на магнитной

1161553

Иммобилизовайную фракцию микросом

35 суспендируют в буфере А, рН 7,4.

Монооксигеназная активность IIo анилину 6,66 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности в Х от исход40 ной 142,6Х) в присутствии гидроперекиси кумола 0,49 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин о при 37 С (сохранение активности от исходной — 207,1X) в присутствии

НАДФН генерирующей системы и О и

0,77 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности от исходной

257,2X) в присутствии НАДФН и О з мешалке) добавляют 139 мл 0,25 М раствора и-бензохинона в 96Х-ном этаноле. Суспензию перемешивают

1 ч при комнатной температуре, затем переносят на воронку Бюхнера и промывают 20Х-ным этанолом, дистиллированной водой, 1 M NaC6 и сно ва дистиллированной водой.

Используют нативные микросомы со следующими характеристиками: выход микросомального белка 24,5 мг белка/г печени, активность по анилину 4,7 нмоль субстрата/HM0JIb цитохрома P-450 в мин при 37 С.

1 г полученного полиэтилена с привитым полиаллиловым спиртом, активированным п-бензохиноном

1 суспендируют в охлажденном буфере А, рН 8,0 (О, 1 M КН РО /ИаОН) со

100 мМ КСР, 1.мМ ЭДТА, мМ дитиотреитола, приготовленном на 20Х-ном (по объему) глицерине. При перемешивании на магнитной мешалке к суспензии носителя добавляют суспензню фракции микросом, содержащую

30 мг белка. Полученную суспензию инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке 24 ч при 4-5o(. Э .затем промывают на воронке Бюхнера буфером Б, рН 7,4 (0,1 M KH>Pg/haOH) с 0,5 М КС1, 1 мМ ЭДТА и t мМ дитиотреитола, приготовленном на 20Х-ном глицерине, а затем аналогичным буфером без КС6 .

Иммобилизованные по данному способу микросомы стабильны при хранении в течение 6 мес при 4-5 С, за это время падение монооксигеназной активности составляет 20Х

Температурный оптимум микросом печени, иммобилизованных на полиэтилене с привитым полиаллиловым о спиртом 37 С, а рН вЂ” оптимум — 7,6.

10 Пример 2. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1..

Отличие заключается лишь в том, что к 1 r полиэтилена с привитым полиаллиловым спиртом, активированным п-бензохиноном, добавляют при перемешивании суспензию фракции микросом, содержащую 100 мг белка.

Монооксигеназная активность по анилину 6,90 нмоль субстрата/нмоль

20 цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности в Х от исходной

147,6) в присутствии гидроперекиси кумола, 0,51 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С

25 (сохранение активности в Х от исходной — 214.6) в присутствии

НАДФН вЂ” генерирующей системы и 0 г и 0,80 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности в Х от исходной

266,5) в присутствии НАДФН и О, .

Применение предлагаемого способа позволяет отказаться от использования дорогого и сложно синтезируемо"

ro карбодиимида-р-1-циклогексил-3-(2-морфомикоэтил)карбодиимид-мето-P-толуолсульфоната и заменить его более доступным и дешевым и-бензохиноном, что значительно упрощает и удешевляет способ иммобилизации.

Использование предлагаемого способа иммобилизации позволяет повысить моноксигеказкую активность до

142-148Х вместо 25Х в прототипе (s присутствии гидроперекиск кумола)

207-215Х (в присутствии НАДФН генерирующей системы и 0 ) и 257-267Х (s присутствии НАДФН и О,).

Способ прост в осуществлении, не требует особых условий при модификации носителя.

1161553

Количество бензохинона, вес.Х

Весовое соотношение белок микросом: носитель

Количество привитого полиаллилового спирта, вес.Х

Моноокснгенаэная активность иммобилизованных микросом,нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при

37 С

3,9

0,3:10

О 3310

0,3:10

I:10

1:10

1:10

0 2:10

0,3 310

1:10

7,5

14,9

6,3

6 5

35,2

6,7. 14,9

35,2

4,&

20,8

20,8

6,7

6,9

t 25:10

20,8

5 6

6,8

5,6

41,7

1:1О

1:10

S 3

Тирам 525 Подписное

ЭЯИЙПИ Государственного комитета СССР по делам изЬбретений и открытий f13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3938/31

Филиал ДПП "Патент", г. Умгород, ул. Проектная,4

Составитель В. Иуронец

"Редактор Н. Киштулииец, Техред А.Бабииец Корректор С. Шекмар

Способ иммобилизации микросом печени Способ иммобилизации микросом печени Способ иммобилизации микросом печени Способ иммобилизации микросом печени 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применено при ферментативной реакции синтеза, а также для фиксации ферментов на носителе
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов, включенных в матрицу гелевого носителя, которые способны осуществлять энзиматическую трансформацию соответствующих субстратов в периодических или непрерывных режимах

Изобретение относится к биотехнологии, инженерной энзимологии и может быть использовано в производстве биопрепаратов

 

Наверх