Способ получения текстильного материала с иммобилизованными ферментами

 

Использование: в химической технологии именно при иммобилизации ферментов на текстильных материалах для применения в медицине при получении перевязочных материалов с биологической активностью . Сущность изобретения: текстильный поликапроамидный материал гидролизуют 2-3 N водным раствором гидроокиси натрия или калия и обрабатывают смесью растворов различных ферментов и желатины, модифицированной глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатины и глутарового альдегида (0,2-1.0):(2,0-2,5):(0,05-0,1) до. массового соотношения текстильного материала и каждого фермента 1000:(0,4-Т,7). Раствор фермента с желатиной, модифицированной глутаровым альдегидом, готовят для каждого фермента в отдельности. Положительный эффект; снижается расход ферментов и достигается высокая ферментативная активность . 1 табл. ел С

° ° /Д

\. ° ° 4 у союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧГСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

BEJlOMCTBO СССР (гОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4898388/14 (22) 29,12.90 (46) 30.04.93. Бюл. N 16 (71) Всесоюзный научно-исследова. ельский институт текстил ьно-галантерейной и ромы шленности (72) Л, Н, Щербакова, Т, Е. Игнатюк, В. В, Рыльцев, B,Н,Филатов, M.Н,Лизанец, П,Й,Толстых и П,Г,Брюсов (56) Авторское свидетельство СССР

N 1615920, кл, А 61 1 15/16, 1989. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕКСТИЛЬНОГО MATEPVIAflA С ИММОБИЛИЗОВАНН ЫМИ ФЕРМЕНТАМИ (57) Использование: в химической технологии,а именно при иммобилизации ферментов на текстильных материалах для применения в медицине при получении пеИзобретение относится к химической

° технологии, конкретно к способу иммобилизации ферментов на текстильных материалах, и может быть использовано в медицине при получении перевязочных материалов с биологической активностью, Цель изобретения — получение полиферментного материала с высокой ферментативной активностью и снижение. расхода фермента:

Поставленная цель достигается тем, что .в способе получения текстильного материа-. ла с иммобилизованными ферментами, включающем гидролиз поликапроамидного . материала 2 — 3 N раствором гидроокиси на трия или калия и обработку раствором фермента; в качестве раствора для обработки используют смесь растворов различных

° ферментов и желатины, модифицированной

„„. Ж„„1811854 А1 (si>s А 61 L15/16; С 12 N 11/18 ревязочных материалов с биологической активностью. Сущность изобретения: текстильный поликапроэмидный материал гидролизуют 2 — 3 N водным раствором.гидроокиси натрия или калия и обрабатывают смесью растворов различных ферментов и желатины, модифицированной глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатины и глутарового альдегида (0,2-1,0):(2,0-2,5):(0,05-.0,1) до массового соотношения текстильного материала и каждого фермента 1000;(0,4-1,7). Раствор фермента с желатиной, моДифицированной глутаровым альдегидом, готовят для каждого фермента в отдельности. Положительный ) эффект . снижается расход ферментов и достигается высокая ферментативная активность. 1 табл, глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатин ы и глутарового альдегида (0,2 — 1,0):(2,0-2,5):(0,05-0-1), а обработку проводят до массового соотношения материала и каждого фермента

1000:(0,4 — 1;7).

Раствор фермента с желатиной, модифицированной глутаровым альдегидом, готовят для каждого фермента в отдельности.

Пример 1. Поликапроамидный текстильный материал в виде трикотажного полотна ластичного переплетения 1х1 обрабатывают 2N водным раствором гидроокиси калия при комнатной температуре в течение 20 ч при модуле 6,.Отмывают дистиллированной водой до рН 7 промывных вод и сушат на воздухе..

1811854

Растворы ферментов для обработки текстильного материала готовят следующим образом;

4 г желатины заливают 100 мл дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения. Параллельно готовят 100 мл

0,2%-ного раствора глутарового альдегида в карбонатной буфере с рН 9. Растворы желатины и глутарового альдегида смешивают в объемном соотношении 1:1 и оставляют на

20 мин в темном месте при комнатной температуре.

0,5 г коллитина растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН4,8, получают 0,1%ный раствор коллитина. 1 г лизоцима растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,2%-ный раствор лизоцима.

К 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 500 мл

0,1%-ного раствора;<оллитина, Массовое соотношение желатины:глутаровый альдегид: фермент — 2:0,1:0;5. К остальным 100 мл смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 500 мл 0.2%-ного раствора лизоцима. Массовое соотношение желатины; глутаровый альдегид;фермент -2:0,1:1. Объемное соотношение раствора желатины, модифицированной глутаровым альдегидом и ферментов (каждого в отдельности) выражается значением 1:5, Смеси выдерживают в темном месте при комнатной температуре в течение 15 мин (в отдельных емкостях), затем объединяют, перемешивают и обьединенную смесь. помещают поликапроамидный материал — на 1 мас,ч, материала 2 части жидкости. Материал смешивают с жидкостью до полного ее поглощения и отжимают до привеса — 190%, Затем сушат на воздухе. Получают материал, содержащий коллитин и лизоцим при массовом соотношении материала, коллитина и лизоцима 1000:0,8:1,7. Бактериолитическая активность материала составляет

248,0 ед.r, протеолитическая активность—

0,53 ПЕ/г коллагенолитическая активность

17,0 мг-экв,лейцина/г носителя.

Пример 2, Обработку текстильного поликапроамидного материала проводят

3N водным раствором гидроокиси натрия по примеру 1.

7,5 г желатины заливают 150 мл дистиллированной воды и раствор готовят по примеру 1.

0,1%-ный раствор глутарового альдегида в количестве 150 мл готовят по примеру

1, Растворы желатины и глутарового альдегида смешивают при их объемном соотношении 1:1, оставляют ча 2g мин в темном месте при комнатной температуре.

0,5 г трипсина растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 6, получают 0,1%-ный раствор трипсина. 1 г лизоцима растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0 2%-ный раствор лизоцима. 0,5 r коллагеназы растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,1%-ный раствор коллагеназы.

Получение растворов ферментов для обработки материала и обработку материала проводят по примеру 1, Массовое соотношение желатина:глутаровый альдегид: фермент для трипсина — 2,5:0,05:0,5; для лизоцима — 2,5:0,05:1; для коллагеназы—

"5 2,5:0,05:0,5. Получают материал, содержащий трипсин, лизоцим и коллагеназу при массовом соотношении материала, трипсина, лизоцима и коллагеназы

1000:0.6: i 2:0,6, 20 П, бтеолитическая активность материала составляет 0,58 ПЕ/г, бактериолитическая активность — . 255 ед./r, коллагенолитическая активность — 12 мгэкв.лейцина/г,, 25

Пример 3. Обработку материала проводят гидроокисью натрия. получение растворов желатины и глутарового альдегида проводят как в примере 1. лизоцима 1000:0,8:0,8

Протеолитическая активность материала 0,35 ПЕ/г, бактериолитическая активность 131 ед./г, коллагенолитическая — 12,8 мг-зкв.лейцина/г носителя.

Пример 4, Обработку материала проводят гидроокисью натрия, получение растворов желатины и глутарового альдеги50

55 да проводят как в примере 1

О, t г трипсина раство1>яют в 400 мл буферного раствора.с рН б, (фосфатный буфер), получают 0,05%-ный раствор трипсина. 0,4 г лизоцима растворяют в 400

0,4 r растворяют в 400 мл буферного

30 раствора с рН 4;8 (фосфатный буфер), получают 0,1%-ный раствор коллитина, 0,4 r лизоцима растворяют в 400 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,1%-ный раствор лизоцима, .

35 К 100 мл раствора смеси желатийы с глутаровым альдегидом добавляют 400 мл

0,1%-ного раствора коллитина. К остальным

100 мл раствора смеси желатины с глутаро- . вым альдегидом добавляют 400 мл 0,1%-но40 ro раствора лизоцима, Массовое соотношение желатина: глутаровый альдегид:фермент для коллатина 2:0,1:0,4; для лизоцима — 2:0,1:0,4. Далее обработку проводят по примеру 1. Получают материал, 45 содержащий коллитин и лизоцим при,массовом соотношении материала, коллитина и

1811854 мл фосфатного буфера с рН 7, получают

0,1% íûé раствор лиэоцима.

К 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 400 мл

0,05-ного раствора трипсина. К остальны .м 100 мл раствора смеси желатин ы с глутаровым альдегидом добавляют 400 мл раствора лизоцима, Массовое соотношение желатины, глутарового альдегида и фермента для трипсина 2:0,1;0,2; для лиэоцимы—

2:0,1:0,4. Далее обработку производят по примеру 1. Получают материал, содержащий трипсин и лизоцим при массовом соотношении материала, трипсина и лизоцима—

1000:0.4:0.8.

Претеолитическая активность препарата 0,55 ПЕ/г, бактериолитическая активность 188,0 ед./г, Для определения протеолитической активности используют стандартный метод для комплексных препаратов протеинов.

Реактивы:

1. Фосфорный буфер 1/15 М, рН 8.

2, 0,34 N NaOH, 3. Трихлоруксусная кислота 10%-ная (TXY).

4, Казеин 2 %-ный. (раствор в фосфорном буфере 1/15 M рН 8)

Проведение анализа: Навеску иммобилиэованного материала помещают в ïðÜбирку (0,0500-0,3000 г. точная навеска); прибавляют 2,5 мл фосфатного буфера(1/15

- М рН 8) и ставят в термастат при 37 на 10 мин. Добавляют в пробирку по 2,5 мл раствора казеина 2%-ного в фосфатном буфере

1/15 M рН 8 и оставляют при 37 С на 1 ч.

После термостатирования содержимое пробирок смешивают с 5 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и оставляют на 10 мин.

Содержимое пробирок фильтруют и из каждого фильтрата отбирают в чистые пробирки по 2 мл. Затем к фильтрату приливают по 2 мл 0,34 N NaOH.

Измеряют оптическую плотность против контроля при 200 нм.

Контрольная проба — навеска носителя беэ иммобилизованного фермента, по массе соответствующая массе испытуемой пробы + 2,5 мл казеина + 2 5 мл фосфатного буфера + 5 мл 10%-ного раствора ТХУ. Отбирают по 2 мл фильтрата также, как в испытуемой пробе, после чего к ним приливают по 2 мл 0,34 N NaOH, Активность определяют по формуле

А— где D — разница между О образца и 0 контрольной пробы, 20 — разведение, бΠ— время (мин), — вес (г), К вЂ” коэффициент тирозиновый (1,52

5 мл/мкмоль).

Определение коллэгенолитической активности иммобилизованного фермента, Реактивы:

1. Трис-буфер 0,1 M рН 4.

10 2. Нингидриновая смесь — 4%-ный раствор нингидрина в метилцелозольве.

3, Цитратный буфер 0,2 М рН 5,1.

4, Хлорид олова — 0,0801 г в 50 мл цитатного буфера 02%-ного, рН 5,1 (хранить в

15 темной склянке).

За 1 ч до определения раствор хлорида олова смешать с раствором нингидрина в метилцелозольве в темной склянке, 5, Раствор коллагена 12%-ный в трис20 буфере(рН 4).

Готовится накануне. За 1 сутки растворить коллаген в трис-буфере и довести его рН до 7 с помощью 1N NaOH, поставить на холод. Утром разогреть на магнитной ме25 шалке и довести рН до 7,5.

6. Раствор эталона 50%-ный. Проведение анализа, Взять навески образцов 0,05 — 0,10 г) - точная нэвеска. К наве. скам добавить 2,5 мл трис-буфера и 2,5 мл

30 раствора коллагена, в котором 5,0 мл трис.

Помещаем в термостат при 37 С на встряхивателе на 5 ч.

3а 30 мин до окончания экспозиции в чистые пробирки помещают по 1 мл нингид35,риновой смеси. В пробирку для установки—

2 мл. К нингидриновой смеси добавляем по

0,2 мл инкубировэйного раствора, а в пробирку для установки нуля — 0,4 мл. Помещаем полученную смесь в кипящую водяную

40 баню (100 С), пробирки прикрепить резинками), на 20 мин. По истечении 20 мин пробирки охладить в холодной воде и добавить„ в каждую по 5 мл 50%-ного эталона, а в пробирку для установки нуля — 10 мл.

45 Измеряем оптическую плотность при

570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, Активность рассчитываем по формуле с использованием калибровочной кривой по лейцину;

50 А=

Я 5 (м<мОпь.экв. лейцинаlмг лрапарата вес навески

В качестве контроля через всю методику проводится образец носителя без иммоби55 лизованного фермента, Определение активности лизоцима, иммобилизованного на текстильных материалах, проводят по турбидиметрической методике., 1811854

Турбидиметрический метод определения активности лизоцима ocuouai на специфическом ферментативном лизисе лизоцимом эталонного штамма. Об активности лизоци ла судим по изменению степе- 5 ни пропускания.

Реактивы:

Фосфатный буфер 1/15 М рН 6,2+0,05

М NaCk

Клеточная суспензия М сгососсоэ 10

lysodeikticus 15 мг в 100 мл буфера, (Химическую посуду, используемую для определения активности лизоцимэ, нельзя мыть детергентами, т.к. они ингибируют ли" зоцим). 15

Навески материала 5 мг, 10 мг и 15 мг или 10 мг, 15 мг и 25 мг и т,д. в зависимости от активности испытуемого материала. В качестве контроля используется носитель без иммобилизованного фермента, 20

Клеточная суспензия Micrococcus

lysodeikticus приготовляется путем встряхивания навески культуры с буферным раствором в течение не менее 30 мин, Взвешенные образцы помещают в ко- 25 нические колбы емкостью 20 мл с притертыми пробками, добавляют в них по 10 мл клеточной суспензии и помещают в термастат при постоянном помешивании на встряхивателе при 37 С на 45 мин, 30

Затем измеряют пропускание T (О) на

Specol при длине волны 640 нм в кювете с толщиной слоя 5 см против воды, Иэ Т образца вычитают Т контрольной пробы, Расчетактивности проводятс использо- 35 ванием стандартной кривой, построенной для кристаллического лизоцима.

Т по кривой соответствует расчет по формуле:

С 10 1000 40

20 где С/20 — содержание лиэоцима в мкг/мл измеряемой пробе, 10 — объем жидкости в кювете, B — масса образца, 45

1000 — перерасчет íà r, 1 ед, активности лизоцима равна уменьшению оптической плотности раствора на

1% в минуту в пересчете на 1 г лизоцима, взятого для определения. 50

Медицинский лизоцим в количестве 2.5 мкг изменяет Т на 27,5 / за 45 мин.

Примечание.

1. Т клеточной взвеси должно быть 68 О

2. При изготовлении суспензии клеточной взвеси перемешивание надо производить сразу же после взятия навески и помещения ее в буферный раствор во избежание склеивания бактер1лальных клеток, Использование раствора желатины более низкой концентрации не представляется возможным, т,к. эти растворы обладают слишком малой вязкостью, и при высушивании сливаются с носителя вместе с иммобилизовэнными на желатине ферментами.

Более высокая концентрация растворов желатины не может быть применена потому, что эти смеси теряют подвижность и не могут быть использованы для смачивэния носителя, поскольку не являются жидкостью, Преимущества предлагаемого способа перед известным представлены в таблице.

Как видно из таблицы, при использовании предлагаемого способа можно получить полиферментный материал с 2 — 3 видами специфической активности, при этом протеолитическая активность материала в 2 — 2,4 раза выше, чем в материале, получаем по известному способу, а расход фермента на получение ПЕ снижен примерно в 25-60 раз.

Формула изобретения

Способ получения текстильного матери8llB с иммобилизованными ферментами, включающий гидролиз поликапроамидного текстильного материала 2 — 3 н водным раствором гидроокиси натрия или калия и обработку раствором фермента, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью получения полиферментного материала с высокой ферментативной активностью и снижения расхода фермента, сначала готовят растворы различных ферментов и желатины, модифицированной глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатины и глутарового альдегида (0,2-1,0):(2,02,5):(0,05-0,1), а иммобилизацию проводят до массового соотношения текстильного материала и каждого фермента 1000:(0,4-1,7).

1811854

Продолжение табл.

Способ пол чения мате иала

Критерии оценки

П е лагаемый

Известный

Количество трипсина, необходимое для получения в материале 1 ПЕ, мг

Бактериолитическая активность, ед.! г.

Массовое соотношейие фермент:носитель

Колл агенолитическая акт. мг-экв. лейцина/г

Массовое соотношение е мент:носитель

0,7-1,1

29-44

131,0 — 255,0 (0,8-1,7):1000

12,0-17,0

0,6 — 0,8:1000

Составитель Т.Шмелева

Техред М.Моргентал . Корректор С. Юско

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. ) жгоРод, уп.Гагарина, 101

Заказ 1541 Тираж " . - . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5