Способ определения внешнесредовых мутагенных воздействий

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНЕШНЕСРЕДОВЫХ МУТАГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ, включающий определение в культуре клеток общего уровня, сестринских хроматидных обменов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения влияния внешнесредовых мутагенных факторов на индивида, воздействие мутагеном осуществляют, при условии, если клетки проходят хотя бы одно клеточное деление, за которое происходит репарация повреждений в клетке в виде сестринских хроматидных обменов , получают истинный спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов и по разнице между общим и истинным спонтанным уровнем опредеi ляют мутагенные воздействия.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИА ЛИСТ ИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51) 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3637345/28-14 (22) 18.07.83 (46) 15. 02. 86. Бюл. У 6 (71) Институт медицинской генетики

АИН СССР (72) Н.П.Бочков, А.Н.Чеботарев, В.И.Платонова и Г.А.Дебова (53) 575.224(088.8) (56) Progress and Topics in Cytogenetics vol. 2, ser. Ed., Avery А., Sandberg, "Sistir chromatid exchange", Alun R. Ziss Inc. New Jork, 1982. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНЕШНЕСРЕДОВЬИ МУТАГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ, включающий определение в культуре клеток общего уровня, сестринских хроматидных обменов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности определения влияния внешнесредовых мутагенных факторов на индивида, воздействие мутагеном осуществляют.при условии, если клетки проходят хотя бы одно клеточное деление, за которое происходит репарация повреждений в клетке в виде сестринских хроматидных обменов, получают истинный спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов и по разнице между общим и (.истинным спонтаннымуровнем определяют мутагенные воздействия.

11751

35

45

Йзобретение относится к медицине, в частности к разделу профессиональной гигиены.

Цель изобретения — повышение точности определения влияния внешнесредовых мутагенных факторов индивида.

Способ предусматривает учет сестринских хроматидных обменов (СХО), при этом общий уровень CXO состоит из двух компонентов: внут- 10 ренних факторов индивида и внешнесредовых, который измеряют у данного индивида на момент забора у него крови.. Эту величину определяют путем добавления БДУ (5-бромдезокси- 15 уридина) только в начале культивирования (на О часу). После одного или нескольких циклов репликации

ДНК в отсутствии внешнесредовых воздействий в культуре лимфоцитов 20 исходный уровень внешнесредовых воздействий репарируется. При позднем добавлении (БДУ) (на 60 часу культивирования) фиксируется только истинный. спонтанный уровень СХО индивида, 25

Разница этих двух величин и составляет часть СХО, связанную с внешне;средовым воздействием.

Пример. Обследуют группу .новорожденных и взрослых, контактирующих с внешнесредовыми воздействиями (лекарственные препараты, курение, алкоголь, выхлопные газы и т.д.). У новорожденных детей кровь берут из пуповины при рождении ребенка, у взрослых — из локтевой вены. Лимфоциты крови культивируют по методу Hanger ford (1965), а именно: к 0,5 мл цельной крови добавляют 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота и 6 мл среды Игла. Для стимуляции лимфоцитов к делению к 8 мл культуры добавляют 0,02 мл фитогемагглютинина (Difco "р"). Культуры помещают в термостат (37 С).

Для каждого индивида ставят

2 культуры из одного и того же образца крови, взятой из локтевой вены у взрослых (3-5 мл), или кро ви пуповины (3-5 мл) после отделения новорожденного от плаценты.

В первую культуру БДУ вводят на О часу культивирования и фиксируют на 72 часу. К этому часу наблюдают максимальное число клеток

65 2

П-го деления. Для разных индивидов частота их составляет от 30 до 607 от всех митозов.

Во вторую культуру (которая для предложенного способа является существенным элементом, а не дополнительным вариантом) БДУ добавляют на 60 часу культивирования, когда основная часть клеток проходит одно деление, Клетки второй культуры фиксируют. За 2 ч до фиксации (любого варианта) в культуру добавляют колхицин до конечной концентрации

0,5 мкг/мл, затем культуральную жидкость с клетками (8 мл) помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют в центрифуге ЦЛК-1 6 мин при

1500 об/мин. После этого супернатант удаляют, оставляя над осадком

0,5 мл жидкости. Клетки ресуспьндируют, приливают к ним до 10 мл

0,57-ный раствор хлористого калия, перемешивают и помещают на 6 мин в термостат (37 С). После этого пробирки центрифугируют при указанных режимах. Супернатант удаляют, а клетки ресуспендируют в 0 5 мл оставшейся жидкости. К этой суспен зия приливают 6 мл фиксатора, состоящего из 3 частей метанола и

1 части ледяной уксусной кислоты и о охлажденного до 0-4 С. После перемешивания пробирки помещают на

15 мин в холодильник, а затем центрифугируют при прежних режимах, супернатант удаляют и добавляют свежий фиксатор. Эту продедуру (промывку) проводят 2 раза. После этого суспензию клеток объемом 0,3 мл раскапывают на влажные охлажденные стекла и высушивают на воздухе и . над пламенем горелки, не допуская возгорания метанола.

Высушенные в течение 24 ч при

37 С препараты окрашивают следуюо щим образом: на 10 мин помещают в водный раствор акридина оранжевого

-5 (10 М), промывают водой и высушивают. Затем препараты тонким слоем 0,07 И раствора Na HÐ04. и облучают 15 мин ультрафиолетовой лампой

СВД-120 А (ДРШ- 120) на расстоянии

30-40 см. После облучения препараты промывают в проточной воде и обрабатывают в на ыщенном растворе гидроокиси бария при комнатной температуре в течение 5 мин. Препараты

Редактор П.Горькова Техред М.Пароцай Корректор Л.Пилипенко

Заказ 658/2

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул, Проектная, 4 промывают и высушивают, а затем. окрашивают 27.-ным раствором Гимза, приготовленным на фосфатном буфере

1175165 4. (рН 6,8) в течение 10 мин. После окраски препараты споласкивают водой и высушивают.