Способ получения лейкоцитарного интерферона

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4- С 12 N 15 00 » .с к щ »»,.-:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬП ИЙ (21) 3775167/28-14 (22) 26.07,84 (46) 23.03.86. Бюл. N 11 (71) Всесоюзный научно-исследователь ский институт молекулярной биологии (72) В.А.Петренко, С.И.Татьков, Л.Н.Семенова, А.А.Ильичев, Г.А.сизенко, В.В.Зорин и И.В.Тимофеев (53) 616.07(088 ° 8) (56) Авторское свидетельство СССР

И» 1093161,: кл. С 12 N 15/00,.1982.

„„SU„„1219647 А (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА, включающий трансформацию реципиентного штамма Escherichia coli рекомбинантной ДНК, кодирующей лейкоцитарный интерферон, с последующим культивированием и выделением целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа, в качестве рекомбинантной ДНК используют ДНК M 131gh

112, а в качестве реципиентного штамма Escherichia coli используют Escherichia,cali 2H 103.

1219647 2

10 ся!

Изобретение относится к молекулярной биологии и генной инженерии и может найти применение в научных исследованиях и производстве противовирусных препаратов.

Цель изобретения — ускорение способа.

Пример 1. Клетки бактерий

E. coli J M 103 трансфицируют ДНК

M13 J g P 112 известным хлоркальци— евым методом и инфицируют фагом М13

IGh112 обычным способом. Клетки высевают на чашки Петри с твердым агаром и отбирают колонии трансформированных бактерий, демонстрирующие активность Р -галактозидазы. Колонии переносят в питательную среду и выращивают в виде суспензии обычнымспособом. Клетки после. отделения центрифугированием и ресуспендирования разрушают .с помощью лизоцима и ультразвука.

Гибридный белок идентифицируют в составе лизата бактерий, белковой фракции, полученной при осаждении сульфатом аммония, или солевых растворов после хроматографии по его антивирусной и ферментативной активности, обнаруживаемой в растворах, и после отделения белка с помощью антител к интерферону. Структура белка подтверждается также данными по связыванию 1253-меченых антител к интерферону препаратом белка, сорбированного на антителах к Р-галактозидазе.

Антивирусная активность гибридного белка.

Отбирают аликвоты бактериального лизата, полученного как описано в примере 1, и определяют антивирусную активность по известному способу с использованием клеток диплоидных фибробластов человека (легкие эмбриона человека), штамма ДК-36 из банка . культур клеток ВНИИ молекулярной биологии. Клетки инфицируют вирусом энцефаломиокардита мьппей (ЕМС).Активность интерферона и активность гибридного белка сравнивают с активностью стандартного лейкоцитарногс интерферона (препарат ВНИИОЧБ, Ленинград, охарактеризованный относительно международного стандарта)

B69/19 методом ингибирования цитопатического эффекта. Определяемая таким способом продукция гибридного белка трансформированными клетками Е.coli

",1М 103 не ниже 10 ед/л (3-10 +

+ 2 10 ед/л по результатам шести независимых опытов). В контрольных экспериментах с лизатами нетрансформированных бактерий или бактерий, трансформированных ДНК, не содержащей гена интерферона, антивирусная активность не обнаруживается.

Обнаружение гибридного белка в колониях трансформированных бактерий °

Бактериальные клетки Е.со1

3М 103 трансфицируют ДНК М 13 35 Ь 112 или инфицируют фагом М 13 1 G h 112 обычным способом и высевают на чашки Петри с твердым агаром, содержащим индуктор Р --галактозидазы изопропилтио P -D-галактопиранозид (ИПТГ), а также хромофорный субстрат

5-броминдоксил-3Р-П-галактопиранозид (Z-Гал). Колонии трансформированных бактерий обнаруживаются по интенсивной синей окраске;

Обнаружение гибридного белка в суспензии трансформированных бактерий.

В этом случае белок обнаруживают так же, как описано для Р -галактозидазы в присутствии о --нитрофенил-(6-3-галактопиранозида (ОНФГ) по характерному окрашиванию в желтый цвет.

Обнаружение гибридного белка в лиза1е трансформированных бактерий.

Лизаты бактерий Е.coli J M 103 трансформированных ДНК M 13 3Gh112, J получают разрушением клеток ультразвуком после обработки лизоцимом, как описано. Аликвоту бактериального лиэата разбавляют в 2 раза буферным раствором Z, добавляют

0,2 объема 0,4Е-ного водного раствора ОНФГ и инкубируют смесь при о

28 С в течение 10 мин — 7 ч в зависимости от концентрации белка. В контрольном опыте используют лизат нетрансформированных бактерий

E.со11 Х М 103. Чувствительность обнаружения химерного белка — менее

10 усл.ед. антивирусной активности

B 1 мл °

Концентрирование препарата гибридного белка и обнаружение последнего в солевых растворах после хроматографии.

К 2 ч. осветленного центрифугированием клеточного лизата трансформированных бактерий Е.coli 3 M 103 добавляют 1 ч. насыщенного раствора

1219647 4

15

35

45

Техред Л.Олейник Корректор Л. Патай, Редактор В. Петраш

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сульфата аммония и осаждают при

10 С фракцию, включающую гибридный о белок. Содержание его во фракции, определяемое по ферментативной активности, как описано в примере 5, составляет 90Х от исходного содержания в лизате. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в буферном растворе, содержащем

0,02 моль фосфата калия рН 7,5, 1 ммоль Р --меркаптоэтанола и

1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты, и диализуют в течение 16 ч о при 4 С против 2 л этого же буферного раствора. Сохранение гибридного белка контролируют по оС -донорной активности и специфическому связыванию с N К-2 антителами к интерферону.

Часть раствора наносят на колонку (0,9х8 см) с ДЕАЭ-целлюлозой, колонку промывают раствором, содержащим

10 ммольтрис -HCE рН 7, 6, 5 ммоль сульфата магния, 20 ммоль Р -меркаптоэтанола (контроль — по оптической плотности фракций при 280 нм) и элюи. руют колонку тем же раствором, содержащим дополнительно хлористый калий в концентрации, линейно возрастающей от 0 до 1 M) по 20 мл. Собирали фракции по 2 мл, контролируя содержание в них суммарного белка (по оптической плотности) и химерного белка. С этой целью из фракций отбирают аликвоты по 100 мкл, добавляют 200 мкл 2 -буферного раствора, 100 мкл 0,4Х-ного раствора ОНФГ, 10 мкл раствора 4-акцептора и обнаруживают химерный белок. Основную часть клеточного белка обнаруживают в 1-5 фракциях, химерный белок — в 6-8 фракциях.

Обнаружение гибридного белка в комплексе с антителами к интерферону.

Моноклональные антитела МК-2 к лейкоцитарному -интерферону человека сорбируют на полистирольную пла,ту для иммунологических реакций известным способом. Гибридный белок сорбируют на антитела из лизатов

Заказ 1234/36 Тираж 490 бактерий или солевых растворов, плату тщательно (16-18 раз) ополаскивают дистиллированной водой и обнаруживают гибридный белок по О- -донорной активности в присутствии ОНФГ и ,,добавленного -акцептора -галакто- зидазы из лизата бактерий Е.coli

JN 103 по характерному яркому окрашиванию лунки в желтый цвет, Оптическую плотность растворов определяют спектрофотометрически при

420 нм. Чувствительность обнаружения гибридного белка — менее

100 усл.ед. антивирусной активности в 1 мл.

Обнаружение гибридного белка в комплексе с антителами к / -галактозидазе.

Антитела к 3 -галактозидазе (фракция иммуноглобулинов, истощенная по белкам К.coli) сорбируют на полистирольную плату для иммунологических исследований обычным способом. Гибридный белок сорбируют на антителах при 4 С в течение 24 ч. Отмытую плао ту инкубируют с мечеными 125 1 (5 ° 10 имп./мин в 100 мкл) моноклональными антителами КК-2 в течение 6 ч при о

4 С. Плату ополаскивают дистиллированной водой (16 — 18 раз) и определяют радиоактивность образцов известным способом.

Использование предлагаемого гибридного белка и способа его получения позволит исследовать экспрессию я регуляцию гена интерферона сс в клетке, определять внутриклеточное,содержание продукта этого гена, Исследовать структурно-функциональную организацию белка, значительно облегчить выделение антивирусного препарата из клеточных лизатов и их очистку.

Полученный препарат гибридного белка используется при определении оптимальных условий получения и очистки интерферона, а также при изучении структурно-функциональной организации интерферона.