Проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток

 

Изобретение относится к области технической физики, а именно, к аналитической микрофлуориметрии. Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитометром-сортировщиком клеток.Устройство состоит из узла эпивозбуждения и сёора флуоресценции. Проточная камера снабжена гидродинамической фокусировкой суспензии клеток. Вход проточной камеры выполнен в виде капилляра. Узел эпивозбуждения i и сбора флуоресценции содержит высокотемпературный иммерсионный объ (Л ектив . Ось капилляра расположена в поле зрения микрообъектива. 3 ил. to О) 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1267231

А1 (д1) 4 G 01 N 21/64

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3815912/24-25 (22) 21.11.84 (46) 30.10.86. Бюл. Р 40 (71) Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова и Институт цитологии АН СССР (72) В.В.Зенин и А.Н.Третьяков (53) 537.35(088.8) (56) Bonner M.А., Hulett Н.R., Sweet R.G. Herzenberd Ь.А. Fluorescence activated cell sorting, Rev. Sci.

Instrum, 1972, ч. 43, р. 404.

Dean P.N. Dual beam sortingat

Livermore. In Flow Cytometry IU, Bergen. 1980, р. 41-44, Koper J.М,, Воппе J. Christiaanse J.G.M., Ploem J.S. An Epiillu, minator/detector unit permitting

arc 1атпр Mumination for fluorescence. activated cell sorters, Cytometry, 1982, v. 3, М 1, рр. 10-14, (54) ПРОТОЧНЫЙ ЦИТОФЛУОРИИЕТР-СОРТИРОВЩИК КЛЕТОК (57) Изобретение относится к области технической физики, а именно, к аналитической микрофлуориметрии.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитометром-сортировщиком клеток.Устройство состоит из узла эпивозбуждения и сбора флуоресценции, Проточная камера снабжена гидродинамической фокусировкой суспензии клеток.

Вход проточной камеры выполнен в виде капилляра. Узел эпивозбуждения и сбора флуоресценции содержит высокотемпературный иммерсионный объектив, Ось капилляра расположена в поле зрения микрообъектива. 3 ил.

1267231

Изобретение относится к технической физике, а именно к аналитической микрофлуориметрии, в частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может быть использовано для скоростного анализа флуоресценции и автоматической сортировки клеток и клеточных органелл, отличающихся по флуоресцентным характеристикам.

Цель изобретения — увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитофлуориметром-сортировщиком клеток, На фиг, 1 представлена схема про- 15 точного цитофгГуориметра-сортировщика клеток, содержащая источник света 1, коллектор 2, светофильтр 3 для выделения снета возбуждения, светоделительную интерференционную пла20 стинку 4, иммерсионный микрообъектив

5 (1, 2, 4, 5. — узлы эпи-возбуждения и сбора флуоресценции) проточную камеру 6 с гидродинамической фокусировкой, капилляр 7, светофильтр 8 для выделения света флуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 для выделения света флуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 (,ФЭУ), сис-. тему анализа и управления сортиров30 кой кцеток 10, пьезоэлектрический преобразователь 11, систему сбора и разделения клеток, содержащую отклоняющие пластины 12, резервуар 13 сбора клеток. 35

На фиг. 2 представлены результаты анализа суспензии лимфоцитон мыши, окрашенных ДНК специфичным флуоресцентным красителем, Пик В получен при анализе суспензии в стеклянном капилляре через объектив 90 ° 1,25 с масляной иммерсией, а пик А — на той же суспензии клеток, но в режиме анализа н струе 45 н воздухе: эпи-возбуждение и сбор флуоресценции происходили через объектив 40"0,65 н струе в воздухе при выходе последней из капилляра..Остальные условия анализа н обоих слу- 50 чаях были одинаковыми. С.Ч. - коэффициент нариации интенсивности флуоресценции, На фиг. 3 представлены гистограммы распределения суспензии культуры у клеток глиомы человека по содержанию

ДНК (по оси абсцисс — интенсивность

Ф флуоресценции клеток (отн. ед;), по оси ординат — количество клеток).

Гистограмма А получена на исходной суспензии клеток, подвергнутой сортировке. Гистограммы Б и В представляют распределение клеток по содержанию ДНК в суспензиях, полученных в результате сортировки клеток исходной суспензии на фракции, соответствующие по содержанию ДНК пикам

1 и 2, Изобретение осуществляется следующим образом.

Свет от источника света 1 собирается коллектором 2, проходит через светофильтр 3, служащий для выделения возбуждающего света, и направляется интерференционной светоделительной пластинкой 4 в иммерсионный микрообъектив 5. Исследуемая суспензия клеток, предварительно окрашенных флу- оресцентным красителем, нытекает из проточной камеры 6 через стеклянный капилляр 7, ось которого расположена в поле зрения иммерсионного микрообъектива 5. Возбуждающий свет вызывает фпуоресценцию клеток, свет которой собирается микрообъективом 5, проходит через светофильтр для выделения флуоресценции 8 и поступает на ФЭУ 9. Сигналы флуоресценции клеток преобразуются в электрические импульсы и подаются в систему анализа и управления сортировкой 10, На выходе капилляра 7 формируется струя в воздухе, несущая клетки.

Пьезоэлектрический преобразователь

11, механически связанный с проточной камерой 6, разбивает струю на капли, После появления клетки с интересующими флуоресцентными параметрами система анализа и управления сортировкой 10 вырабатывает прямоугольный импульс, задержанный по времени от момента регистрации данной о клетки на время, необходимое ей для достижения точки разбиения струи на капли, В течение импульса образуется

4-5 капель, н одной из которых находится клетка, которую надо отсортировать, Импульс заряжает струю, и в результате отделяющиеся капли оказынаются заряженными, и, двигаясь между отклоняющими пластинами 12, в постоянном электрическом поле, от.клоняются и попадают н резервуар 13 для сбора клеток.

Прибор изготовлен на базе люминесцентного микроскопа МЛ-2, В качестве источника возбуждающего света применена ртутнаялампа сверхвысокого з 1267 давления gPIil-250-2, питаемая от источника постоянного тока ИП-16М. Возбуждение и сбор флуоресценции производитея через микрообъектив 90"

«1,25 с масляной иммерсией. Выход проточной камеры выполнен в виде цилиндрического капилляра, Для данного микрообъектива использован капил- ляр с внутренним около 150 мкм и наружным около 450 мкм диаметром. Флу- 10 оресценция клеток регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя

ФЭУ-118.

Система амплитудного анализа и управления сортировкой содержит мно- 15 гоканальный амплитудный анализатор

АИ-1024-95, блок формирования задерж-. ки зарядного импульса, ультразвуковой генератор для питания пьезоэлектрического преобразователя и источни-20 ка высокого напряжения, подаваемого на отклоняющие пластины. В качестве резервуара для сбора клеток применены центрифужные пробирки объемом

5 мл. Проточная камера, отклоняющие 25 пластины и резервуар для сбора клеток крепятся на предметном столике микроскопа. Выведение объектива на ось капилляра производится с помощью препаратоводителя. 30

На данном проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток было оценено увеличение чувствительности предлагаемого устройства по сравнению с прототипом. На фиг.. 2 показаны резуль: 35 таты анализа суспензии лимфоцитов мыши, окрашенных ДНК вЂ” специфичным красителем. Пик Б получен при возбуждении и сборе флуоресценции через микрообъектив 90 " 1,25 с масляной 4> иммерсией в капилляре. Пик А получен на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе, сходным с режимом, примененным в прототйпе: эпи-возбуждение и сбор флуорес231 ценции происходили через суховоздушный микрообъектив 40>0,65 (в прототипе 32 0,60) в струе в воздухе при выходе последней из капилляра. Остальные условия эксперимента в обоих случаях одинаковы. Сравнение величин сигналов флуоресценции и коэффициентов вариации, рассчитанных для пиков А и Б (фиг. 2), показало, что чувствительность предлагаемого устройства приблизительно в 9 раз выше по сравнению с чувствительностью про. тотипа при одновременном увеличении точности анализа, определяемой по коэффициенту вариации приблизительно в 3 5 раза.

На проточном цитометре-сортировщике клеток была проведена сортировка суспензии клеток по содержанию

ДНК (фиг. 3). Чистота отсортированных фракций (Б, В) составила 93 .

Ф о р м у л а изобретения

Проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток, содержащий узел эпивозбуждения и сбора флуоресценции, на выходе которого установлен микрообьектив, проточную камеру с гидродинамической фокусировкой суспензии клеток, корпус которой механически связан с пьезоэлектрическим преобразователем, систему анализа и управления сортировкой клеток, причем,на выходе камеры установлена система сбора и разделения клеток, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью увеличения чувствительности и точности измерений флуоресценции, выход про-, точной камеры выполнен в виде капилляра, ось которого расположена в поле зрения микрообъектива, выполненного.иммерсионным и высокоапертурным.! 2б7231

h9 - dg ллюпю

f000 дС/77б ии(ачба Ф) 1f00

Фиг,З

Составитель Н.Зоров

Редактор Т. Митейко Техред H.Èîðãåíòàë: Корректор К. Рошко

Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, F,-35, Раушская наб., щ. 4/5

Заказ 5755/38

Производственно- полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул . Проектная, 4