Способ определения количества микроорганизмов в почве

 

Изобретение относится к области микробиологии. Целью изобретения является повьшение точности способа . Непосредственно в почве измеряют количество микроорганизмов по скорости протекания микробиологического процесса. Для этого в почву вно- . сят субстрат, ассимилируемый микроорганизмами . Химическая природа субстрата диктуется задачей исследования , т.е. тем, количество каких микроорганизмов требуется определить. Для определения биомассы денитрифицирующих микроорганизмов в образец сгочвы вносят нитрат калия, для нитрификаторов - сульфат аммония. Количество вносимого субстрата составляет 0,5-2,5 мг/г почвы. Продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста и составляет 5 - 96 ч. В исследуемые образцы почвы вносят субстрат и инкубируют при 25 С в ультратермостате. В процессе инкубирования измеряют скорость потребления субстрата. Рассчитывают метаболический коэффициент (q) по формуле 1:Y dlnVrdt, где V - скорость потребления субстрата; Y - экономический коэффициент; t - время инкубации. Разделив величину скорости потребления субстрата в начальный момент после внесения его в в почву на величину метаболического коэффициента, получают величину биомассы микроорганизмов г исследуемом образце почвы. Способ позволяет определять не условные, а абсолютные значения микробной биомассы, выявляет только жизнеспособные и метаболи-- чески активные микроорганизмы. Рост микроорганизмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных условиях, что гарантирует точность и полноту учета. 5 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

46 А1 (19) (И) (504 С 12 1 06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н двтоесномч свидетельству

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3776702/31-13 (22) 24.07.84 (46) 23.03.87. Бюл, Ф 11 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) В.Д.Афремова, Н.С.Паников и И.В.Асеева (53) 663.11:576.8.093.6(088.8) (56) Методы почвенной микробиологии и биохимии,/ Под ред.,Д.Г.Звягинцева. — МГУ, 1980, с. 17.

Ausmus. — Bull. Ecol. Res. Commun. Stockholm, 1973, ч. 17, р.223234.

Перт Дж, Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - M.: Мир, 1978, с. 30. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕ (57) Изобретение относится к области микробиологии. Целью изобретения является повыщение точности способа. Непосредственно в почве измеряют количество микроорганизмов по скорости протекания микробиологического процесса. Для этого в почву вносят субстрат, ассимилируемый микроорганизмами. Химическая природа субстрата. диктуется задачей исследования, т.е.. тем, количество каких микроорганизмов требуется определить. !

Для определения биомассы денитрифицирующих микроорганизмов в образец с очвы вносят нитрат калия, для нитрификаторов — сульфат аммония. Количество вносимого субстрата составляет 0,5-2,5 мг/г почвы. Продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста и составляет 5 — 96 ч. В исследуемые образцы почвы вносят субстрат и инкуо бируют при 25 С в ультратермостате.

В процессе инкубирования измеряют скорость потребления субстрата. Рассчитывают метаболический коэффициI ент (q) по формуле l:Л dlnV:dt, где V — скорость потребления субстрата; Y — экономический коэффициент;

t — - время инкубации. Разделив величину скорости потребления субстрата в начальный момент после внесения его в в почву на величину метаболического коэффициента, получают величину биомассы микроорганизмов г исследуемом образце почвы. Способ позволяет определять не условные, а абсолютные значения микробной биомассы, выявляет только жизнеспособные и метаболи» чески активные микроорганизмы. Рост микроорганизмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных условиях, что гарантирует точность и полноту учета, 5 табл. где Х вЂ” биомасса микроорганизмов;

S — концентрация субстрата;

q — - максимальная удельная скорость микробиологического процесса;

Кш — константа насьпцения; численно равная той концентрации субстрата, при которой Ч=0,5Ч„ „

При внесении в почву насьпцающих концентраций субстрата ($ » К„) уравнения {1) упрощается

Ч-qX

V0 х = — -->

Ч (2) 45 где Ч вЂ” скорость потребления субстрата в начальный момент после внесения его в почву, мг/ч г почвы; †. пересчетный коэффициент, удельная скорость метаболизма, мг субстрата/ч мг биомассы.

Для измерения q определение У проводят один раз с известным количеством микроорганизмов, это количество устанавливают весовым методом путем микроскопического подсчета клеток

И Т Де

1 2982

Изобретение относится к почвенной микробиологии и может быть использовано для оценки микробиологических факторов плодородия почвы, эффективности действия бактериальных удобрений, при санитарно-гигиеническом обследовании природных объектов.

Цель изобретения — повьппение точ- ности способа путем измерения количества микроорганизмов (биомассы или численности клеток) по скорости протекания микробиологического предела непосредственно в почве.

На основании изучения особенностей кинетики роста микроорганизмов в почве разработан прием прямого определения коэффициента пересчета величины скорости процесса и величины микробной биомассы или численности.

Скорость Ч превращения микроорганизмами подавляющего большинства экэогенных субстратов зависит от их концентрации и от количества микроорганизмов и ° S Х

Ч = (1)

К,.„S

46

Применительно к почве нахождение

q подобным образом невозможно, так как истинные размеры микробной биомассь. в почве неизвестны, а внесенные в почву микроорганизмы не тождественны эндогенной микрофлоре.

Это диктует необходимость нахождения величины q для каждой конкретной ситуации. Прием нахождения q заключается в прослеживании динамики нарастания скорости потребления субстрата в процессе роста микроорганизмов и расчета по формуле: — (3)

din V IS alan где p — удельная скорость роста мик-, роорганизмов;

У„ — экономический коэффициент, выход биомассы на единицу потребленного, мг биомас. сы/мг субстрата; — время инкубации.

Для экспериментального определения pi достаточно получить данные по динамике нарастания Ч в первые часы или сутки после внесения в почву субстрата. Величина Y„ представляет собой для данной физиологической группы относительно постоянную величину, например: для микроорганизмов, использующих глюкозу У,ц, 0,6 гС = биомассы/rC-субстрата: для нитрификаторов У„, = 0,7 ° 10 клеи ток/мкг N; для денитрификаторов

У,ц 2,67 г сухого веса биомассы/г

N; величину 7„ находят по справочным данным для каждого конкретного случая,<либо определяют экспериментально, исходя из соотношения

dX

dS

Согласно предлагаемому способу в почву вносят субстрат не только для измерения Ч, но и для того, чтобы микроорганизмы, использующие данный субс грат, работали по экспоненциальному закону:

Х=Х ехр 1ь(с-<), где — продолжительность лаг-перио-. да.

Условия, необходимые для реализации экспоненциального роста микроорганизмов: в почву вносится субстрат, ассимилируемый микроорганизмамн, метаболи12982 эируемый, но не дающий прироста количества клеток субстрат (подобный тетразолиуму и .прочим ксенобиотикам) применяться не может, химическая природа ассимилируемого субстрата дик" туется задачей исследования, т.е. тем, количество каких микроорганизмов требуется определить; количество вносимого субстрата S должно многократно превышать констан-!О ! ту насыщения микроорганизмов Кэ (10 М для большинства видов) и обеспечить нелимитированный рост на протяжении по крайней мере 0,3-3 генераций (5-96 ч). Расчет величины осу- 15 ществлякт по формуле

Бс = Хоп/Уф где Х, — предполагаемое количество микроорганизмов в почве; 20 п — число генераций.

На практике численное значение Х трудно оценить заранее, но эмпирически установлено, что для обеспечения 0,3-3 генераций микроорганизмов в почву достаточно внести 0,52,5 мг/г субстрата, являющегбся источником энергии; продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста или времени их генерации. Чем выше р, тем короче срок инкубации. Практическим критерием для выбора срока инкубации является следующий: величина V должна достоверно возрасти по сравнению с V численным значением Ч в момент внеи сения субстрата в 1,2-12 раз. Эквивалентная форма рекомендации по установлению срока инкубации: 0,3-3 времен генерации микроорганизмов или

5-96 ч.

Пример 1. Определение био», массы микроорганизмов, способных использовать глюкозу.

5 r дерново-подзолистой почвы помещают в пенициллиновый флакон, вносят 12,5 мг глюкозы в виде концентрированного раствора, закрывают герметично резиновой пробкой и инкубируют при 25»0,1 С в течение 30 мин.

После этого отбирают шприцем пробу воздуха, измеряют в ней концентрацию СОг на газовом хроматографе и снимают резиновую пробку с флакона.

В течение последующих 30 мин флакон инкубируют без пробки при той же

О температуре 25 С, затем флакон закры46 4 вают пробкой еще раз на 30 мин и повторяют измерение скорости образования СС, после чего инкубируют 30 мин без пробки и т.д. Всего приводят пять измерений скорости образования СОг через каждый час. Результаты определений сведены в табл.1.

d1nV

Pо формуле п = — — — . находят среднее

Б: значение ш = 0,021 ч . Величину У„ принимают равной 0,67 г СО -С/г С би-. омассы. Отсюда находят Ч=0,014 мкг

С/мкг С биомассы и биомассу микроорганизмов, способных расти на глюкозе, 355 мкг С/r почвы.

Пример 2. 5 г типичного мощного чернозема помещают в пенициллиновый флакон, вносят 12,5 мг глюкозы в виде концентрированного раствор ра, закрывают герметично резиновой пробкой и инкубируют при 25"0,1 С течение 30 мин. После этого отбирают шприцем пробу воздуха, измеряют в ней концентрацию СО на газовом хромато г графе и снимают резиновую пробку с флакона. В течение последующих 30 мин флакон инкубируют беэ пробки при той о, же температуре 25 С„ затем флакон закрывают пробкой еще раз на 30 мин и повторяют измерение скорости образования СОг, после чего инкубируют

30 мин без пробки и т.д. Всего проводят пять измерений скорости образования СОг через каждый час. Результаты определений приведены в табл.2.

Результаты вычислений: р =0,03 ч

q = 0,0201 мкг С/ч мкг С биомассы, биомасса микроорганизмов 299 мкг С/г

-почвы.

"Пример 3. Определение количества микроорганизмов, окисляющих

МН4 ° .

100 r почвы помещают в стеклянный кристаллизатор, вносят. сульфат аммо-. ния в количестве 0,59 мг/г почвы (125 мкг N/г) и инкубируют при 25 С в течение 3 сут. Периодически отбирапе пробы почвы (1 r) и определяют остаточное содержание аммония с реактивом Несслера в солевой (КС1) вытяжке. Результаты определения приведены в табл.3.

Результаты вычислений: р =1,25 сут .

Величину У„, принимают равной 0,7 л

6 х 10 клеток/мкг N. Величину биомассы нитрификаторов рассчитывают по формуле (2):Х = 2,66 10 клеток/г почвы или 0,35 мкг С биомассы/г почвы.

1298246

П р н м е р 4. Определение биомассы денитрифицирующих микроорганизмов.

100 г чернозема южного1помещают в вакуум-эксикатор и инкубируют при

20 С в атмосфере чистого азота с 5 нитратом калия. Количество вносимого субстрата денитрификации 2,5 мг/г почвы (340 мкг N/г) время инкубации

4 сут (96 ч). Сразу после внесения соли, а также на 1-4 сут инкубации отбирают пробы почвы по 1 r и определяют в них остаточное содержание

N0 с дисульфофеноловой кислотой °

Результаты определения приведены в табл.4. 15

Удельная скорость роста микроорганизмов а в среднем равна 0,01 ч

-3 учитывая, что экономический коэффициент для данной физиологической группы микроорганизмов Y=2,67 r био- 20 массы/г азота, получают величину

q 3,74 10 мкг N/ч мкг биомассы.

Количество биомассы денитрифицирую" щих микроорганизмов равно 0,92/3,74х х10 нли 256 мкг. 25

Пример 5. Определение проводят по примеру 4, но с внесением в почву 0,5 мг/г нитрата калия (69 мкг N/r почвы), время иикубации

5 ч. Результаты определения приведе- 30 ны в табл.5.

-1

Результаты расчета: р =0,094 ч

q 3,525 10 мкг Ы/ч мкг биомассы, Х 238 мкг.

Пример 6. Определение количества микроорганизмов в почве методом посевов.

1 г дерново-подзолистой почвы растирают в фарфоровой ступке, заливают

100 мл стерильной воды, диспергируют иа ультразвуковом деэинтеграторе (0,2 А, 2 мин) и готовят серию разведений в стерильной воде (10, 10

10 ) 0,05 мл из каждого разведения наносят на поверхность агаризо- 45 ванной среды (ИНА, бульон, предварительно разбавлен в 10 раз), разлитой в чашки Петри. После 1-суточной инкубации прикомнатиой температуреподсчитывают количествовыросших колоний. Ре- 50

6 эультаты учета3,8 10 клеток/г почвы.

Аналогично проводят определение количества микроорганизмов в образце типичного мощного чернозема. Pe"

6 эультаты учета 3,1 10 клеток/г почвы.

П р и и е р 7. Определение биомассы клеток по скорости восстановления красителя тетразолиума.

10 г дерново-подзолистой почвы помещают в коническую колбу. вносят 1О мл 1Х-ного раствора трифенилтетразолийхлорида (TTX) в 0,1 И трис-HCI буфера рН 7,6. Суспензию перемешивают и Инкубируют в анаэростате (разрежение 1 атм) при 37 С в течение 2 ч. Затем в колбу вносят

10 мл экстрагента (смесь ацетона, СС11 и этанола в соотношении 7:2:l), встряхивают, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при

546 нм. По калибровочной кривой, связывающей оптическую плотность раствора с концентрацией формаэанов (Ф) находят скорость реакции восстанов-ления красителя 35 мкг Ф/ч г почвы.

Аналогично проводят определение с образцом типичного мощного, чернозема. Результаты определения

150 мкг. Ф/ч г почвы.

Таким образом, применение известного способа (пример 7) позвбляет получить лишь условные величины микробной биомассы в единицах ферментативной активности — так называемая дегидрогеназная активность почв (ДА). о

В черноземе ДА в 4 раза выше, чем в дерново-подзолистой почве, т.е. чернозем содержит в 4 раза больше микроорганизмов. Однако метод посева выявляет приблизительно равное количество микроорганизмов в двух исследованных почвах.

Предлагаемый способ как метод посевов, выявляет приблизительно равные запасы микробной биомассы в двух почвах, но дает не условные, а а6солютные значения микробной биомассы, Кроме того, он позволяет найти причину более высокой ферментативной активности в черноземе: в этом почвенном образце численное значение

q выше, чем в дерново-подзолистой почве. При этом выявляет только жизнеспособные и метаболически активные микроорганизмы (покоящиеся микроорганизмы не успевают прорасти на вносимом в почву субстрате за несколько часов измерений), рост микроорганизмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных услови". ях, что гарантирует точность и полноту учета.

Формула изобретения

Способ определения количества микроорганизмов в почве путем внесе0 1 2

Время инкубации, ч

Скорость образования СО, мкг. С/ч r

5 0 5 05 5 21 5 32 5 46 5 6

Та.блица 2

0 1

Время инкубации, ч

Скорость образования СО, мкг С/ч ° r

6,0 6,2 6,4 6,5 6,8 7,0

Таблица 3

Время инкубации, ч

0 12 24 38 48

62 72

Остаточное содержание аммония, мкг N/r 125 )22 112 100 80

50 0

Скорость потребление аммония, мкг N/÷.r 0,25 0,83 0,86 2,00 2,14 5,0

Таблица 4

1 1

Время инкубации,ч 0 24 48 72 96

Остаточное содержание нитратов, мкг N/ã

340 318 284 246

200

Скорость потребления нитратов, мкг N/г ч

0,94 1,42 1,58

1,92

7 1298246 8 ния субстрата в анализируемый мате- рование осуществляют в течение 5риал, инкубирования, измерения на— 96 ч, дополнительно измеряют скочальной :.корости потребления субст- рость потребления субстрата в прората и последующего расчета количест- цессе инкубирования, а метаболичесва микроорганизмов по отношению на- 5 кий коэффициент определяют по форчальной скорости потребления субст- муле рата к метаболическому коэффициен- I din V ту, отличающийся тем, Y dt что, с целью повышения точности спо- где Ч вЂ” скорость потребления- субстсоба, используют ассимилируемые фор- 1О рата; мы.субстрата, субстрат вносят в ко- Y — экономический коэффициент; личестве 0,5-2,5 мг/г почвы, инкуби- — время инкубации.

Таблица 1

1298246

Таблица 5

Время инкубации, ч 0

64,85

69,10

67,00

0,84

0,86

Составитель В.Романова

Редактор Н.Рогулич Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи

Заказ 862/26 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4

Остаточное содержание нитратов, мкг N/г почвы

Скорость потребления нитратов, мкг N/ч г почвы

Г ("