Способ определения активности грамицидина @

 

Изобретение относится к медицине . Цель изобретения - сокращение времени анализа. Готовят бактериальную суспензию. Стандартный и испытуемый препараты грамицидина С в разных разведениях .помещают в кюветы люминометра и добавляют туда по 1 мл бактериальной суспензии. В течение ; 20 мин регистрируют свечение. В опытной пробе определяют степень падения люминесценции по сравнению со стандартом . 2 табл.

СОКИ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (д) 4 G 01 N 33/15, С 12 О„ 1/02, 1/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Я!

Н ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ВМ .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3828354/28-14 (22) 24.12.84 (46) 07.09.86. Бюл. У 33 (71) Красноярский государственный университет и Институт биофизики

СО АН СССР (72) В. Б. Гуревич, И,Ю. Виделец и А. Н. Шендеров (53) 615.77.99(088.8) (56) Государственная фармакопея СССР, . 1.9.68, с. 943.

„,SU 25592Î А 1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ГРАМИЦИДИНА С (57) Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - сокращение времени анализа. Готовят бактериальную суспензию. Стандартный и испытуемый препараты грамицидина С в разных разведениях, помещают в кюветы люминометра и добавляют туда IIO 1 мл бактериальной суспензии. В течение

20 мин регистрируют свечение. В опытной пробе определяют степень падения люминесценции по сравнению со стандартом. 2 табл. с

1255920

Таблица 1

Проба Концентрация

Эксперимент

Расчетная концентрация антибиотика, ед/мл грамицидина, ед/мл

О, 6 0,09 0,13

0,27 0,22 0,28

0,45 0,35 0,41

Стандарт 30

Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано для определения активности грамицидина С.

Цель изобретения — сокращение вре- 5 мени анализа и его упрощение.

Цель достигается за счет использования в качестве тест-объекта суспензии Photobacterium Keiopnathi, что позволяет оценить активность антибиотика по степени падения люминесценции.

Культуту Photobacterium (eiognathi выращивают на полусинтетической среде до достижения максимальной интенсивности свечения. Готовят бактериальную,суспензию путем центрифугирования и ресуспендироввния в фосфатносолевом буьере до концентрации око1О ло 10 кл/мл. Полученную суспензию хранят при +4 С до использования (не более 2-х суток).

Для проведения анализов используют бактериальную суспенэию, содержащую от 1 10 до 2 10 кл/мл.

Концентрацию грамицидина определяют следующим образом.

Стандартный и испытуемый препараты грамицидина в разных разведениях помещают в кюветы люминометра„ туда 30 же добавляют по 1 мл бактериальной суспенэии. В течение 20 мин регистрируют свечение на ленте самописца от всех кювет. Затем определяют степень падения люминесценции в опытной пробе по сравнению со стандартом.

Пример 1. Для получения исходного препарата индикаторных бактерий штамм Photobacterium Peiognathi засевают в 100 мл полусин-.етической 4() среды. Колбу с культурой инкубируют о при 28 С на качалке, регистрируя рост и развитие люминесценции onu\ саннь:и методами. После достижения максимальной интенсивности свечения клетки отделяют от среды центрифугированием (5000 g, 10 мин) и суспендируют в 10 мл 0,1 M фосфатного буфера рН 7,1, содержащего 0,5 M NaC1.

Полученная таким образом суспензия î содержит около 1П кл/мл и может храниться без значительной потери люминесцентной активности в течение

2 сут при +4 С.

Количественное определение грамицидина основано на сравнении степени угнетения свечения разными,концентрациями стандартного и определяемого препаратов.

Исходную суспензию бактерий разводят в фосфатно-солевом буфере до

1 конечной концентрации 5 10 кл/мл, В кюветы наливают по 1 мл бактериальной суспензии и такое количество стандартного раствора антибиотика, чтобы его концентрация в кюветах составляла 20 ед/мл, 25 ед/мл, 30 ед/мл. В качестве опытного образца в кюветы с суспензией вносят известное количество того же стандартного раствора грамицидина. Все пробы стандартные в двух, а опытные в трех повторностях помещают в установку,. в которой регистрируют люминесценцию (1 ) в течение 20 мин на ленте

Е самописца, При обработке результатов в качестве количественной меры степени угнетения свечения используют параметры, равные отношению свечения после 15 мин контакта бактерий с антибиотиками к его исходному уровню (3, /3 ).

Значения этого параметра усредняют по говторностям и заносят в таблицу.!

255920

Продолжение табл,!

Расчетная концентрация антк.ш биотика, юд7ил

Концентрация грамицидина, ед/мл

Проба ксперимент

0,15

Опытные 27

27

О,ll

0, 25

По полученным значениям для каждого иэ экспериментов строят калибровочный график и по нему определяют расчет— ную концентрацию антибиотика в пробе 20

Расхождение между расчетными и истинными концентрациями антибиотика в пробах не превышает 107.

Пример 2. Исходную суспензию бактерий разводят до концентраКонцентрация антибиотика в пробе при соотношении 3 /3., ед/мл

Концентрация бактерий в суспензии, кл/мл

0 23 26 29 32

2 10

5 10

1 10

1,10,78 0,,63 0 54 0,48

1,0 0 58 0 51 0,37 0,27

1,1 0,36 0,31 0,26 0,20

Способ определения активности грамицидина С путем контактирования тест-объекта с антибиоТиком с последующей оценкой его действия на тестобъект, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа и его упрощения, в качестве тест-объекта к антибиотику добавляют

cycnessvm Photobacterium teiognathi

8 с концентрацией клеток 1.10 — 2-10 в мл, а активность антибиотика определяют по степени падения люминесценции. измеренеобходимые проводить ния.

БНИ11!1И Заказ 4845/43

Тираж 778 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

В указанном диапазоне концентра- 40 ций бактерий зависимость степени угнетения люминесценции от концентрации антибиотика носит практически линейный характер, что позволяет

Время анализа составляет l ч по сравнению с 20 ч по известному способу, также сокращается число опера- 50 ций за счет устранения ряда операций по культивированию бактерий на чашках Петри. ций 2 10, 5-10 ", 1 ° 10 кл/мл. Каждое из разведений разливают в кюветы по 1 мл, к которым добавляют 23, 26, 29 и 32 ед/мл грамицидина. Регистрируют свечение всех кювет в течение 20 мин и определяют степень угнетения свечения эа 15 мин.контакта с антибиотиком. Результаты измерений сведены в табл, 2.

Т а б л и ц а 2

I о

° .

Формула изобретения