Способ определения катехоламинов в плазме крови и способ получения флюоресцентно меченого катехоламина

 

Изобретение относится к биохимии , касается способа определения и получения меченых соединений и предназначено для иммунофлюоресцентного определения катехоламинов. Цель изобретения - повышение чувствительности определения катехоламинов. Раствор антител к катехоламину смешивают с пробой плазмы.. Добавляют в эту смесь меченый катехоламин. Смесь инкубируют , Затем определяют поляризацию флюоресценции реакционной смеси и по значению поляризации определяют количество катехоламина в пробе. Поляризак;ия флюоресценции обратно пропорциональна логарифму концентрации катехоламина . При получении флюоресцентно меченого катехоламина его растворяют в боратном буфере. Затем в раствор добавляют триэтиламин и флюоресцеинизотиоцианат. Смесь инкубируют , Разделение -смеси осуществляют восходящей хроматографией. Элюирование катехоламина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой. 2 с.п. ф-лы. 1 ил, SS СО О СП О О ро

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3928402/28-14 (22) 31.07,85 (46) 23.04.87. Бюл. Ф 15 (71) Таджикский государственный университет им. В,И.Ленина и Институт сердечно-сосудистой хирургии им.А;Н.Бакулева (72) С.М.Быстряк, С.Б,Дейч, П.M,Àøèðoâ, С.П.Смотров, Д,Б.Сапрыгин, Л.А,Бокерия, В,Н.Титов, З.М.Киселева и Ф.Б,Левин (53) 616.07 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1140415, кл, С 07 С 91/34, 1984, Магилина Э,Ш., Меньшиков В.В, Клиническая биохимия катехоламинов.-М,:

Медицина, 1967,с,113-127, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛ100РЕСЦЕНТНО МЕЧЕНОГО КАТЕХОЛАМИНА (57) Изобретение относится к биохимии, касается способа определения и получения меченых соединений и пред(51)4 С 01 И 33/533, С 07 С 9 !/34 назначено для иммунофлюоресцентного определения катехоламинов. Цель изоб— ретения — повышение чувствительности определения катехоламинов. Раствор антител к катехоламину смешивают с пробой плазмы. Добавляют в эту смесь меченый катехоламин. Смесь инкубируют ° Затем определяют поляризацию флюоресценции реакционной смеси и по значению поляризации определяют количество катехоламина в пробе. Поляри— за ия флюоресценции обратно пропорциональна логарифму концентрации катехоламина, При получении флюоресцентно меченого катехоламина его растворяют в боратном буфере. Затем в раствор добавляют триэтиламин и флюоресцеинизотиоцианат. Смесь инкубируют. Разделение смеси осуществляют восходящей хроматографией, Элюирование катехоламина с носителя осущеСтвляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой. 2 с.п. ф-лы, 1 ил.! 30560. Изобретение относится к биохимии и к химии получения новых флюоресцентно меченых соединений и может быть использовано для иммунофлюоресцентного определения катехоламинов в плазме крови.

Цель изобретения — повышение чувствительности определения катехоламинов за счет иммунофлюоресцентного определения при помощи флюоресцентно !0 меченых катехоламинов, На чертеже приведен калибровочный график зависимости поляризации флюоресценции при 516 нм (Р) от логарифма концентрации катехоламина, f5

Способ определения катехоламинов в плазме крови осуществляется следующим образом.

Раствор антител к катехоламипу смешивают с пробой плазмы, затем до- 20 бавляют в смесь катехоламин, меченый флюоресцеинизотиоцианатом, реакционную смесь инкубируют при 20-30 С в течение 40-60 мих, после чего опредепяют поляризацию флюоресценции реакционной смеси при 516 нм. По значению поляризации определяют количество катехоламина в пробе °

Поляризация флюоресценции обратно пропорциональна логарифму концент- 30 рации катехоламина. Определение ведется по калибровочной кривой с использованием формулы

С = 10 ед.с ° 101,S5

35 где С вЂ” концентрация катехоламина;

101,55 — коэффициент разведения пробы, Пример 1, Определение норадреналина, 40

К 1 мл разведенной в 400 раз антисыворотки к норадреналину добавляют 10 мкл пробы плазмы крови донора, Затем в смесь вносят 5,5 мкл раствора„ содержащего 5 -10 М норадреналина„ меченого флюоресцеинизотиоцианатом, и инкубируют при 30 С в течение о

60 мин. Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, помещают в спектрофлюориметр HitachiN-850 и определяют поляризацию флюоресценции при 516 нм, При этом значение поляризации составляет 0,165. По измеренному значению поляризации, используя калибровочный график, рассчитывают количество норадреналина в пробе,которое составляет 5,4 10 N.

Пример 2. Определение адреналина.

2

К 1 мл разведенной в 400 раз антисыворотки к адреналину добавляют

10 мкл пробы плазмы крови донора,Затем в смесь вносят 5,5 мкл раствора, содержащего 5 !О М адреналина, меченого флюоресцеинизотиоцианатом, и о инкубируют при 20 С в течение 40 мин.

Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, помещают в спектрофлюориметр Hitachi11-850 и опредепяют поляризацию флюоресценции при

516 нм, При этом значение поляризации составляет 0,325, По измеренному значению поляризации флюоресценции, используя калибровочный график, рассчитывают количество адреналина в пробе, которое составляет 1,2 х х 10 М, Пример 3. Определение дофамина °

К 1 мл разведенной в 400 раз ан..исыворотки к дофамину добавляют

10 мкл пробы плазмы крови донора, Затем в смесь вносят 5,5 мкл раствора, -8 содержащего 5 .10 М дофамина, меченого флюоресц инизотиоцианатом, и инкубируют при 25 С в течение

50 мин. Затем реакционную смесь переносят в кварцевую кювету, помещают в спектрофлюориметр Hitachi М-850 и определяют поляризацию флюоресценции при 516 нм, При этом значение поляризации составляет 0,300., По измеренному значению пoJ::ÿpèçàöèè флюоресценции, используя калибровочный график, рассчитывают количество дофамина в пробе„ которое составляет 1,08 х х 1О М.

Чувствительность иммунофлюоресцентного способа определения катехоламинов в плазме составляет 10 " М, Способ получения флюоресцентно меченого катехоламина осуществляется следующим о бра.зом.

Катехоламин растворяют в обратном буфере рН 0-10,0, в раствор добавляют триэтиламин и флюоресцеинизотиоцианат так., чтобы молярное соотношение катехоламина, триэтиламина и флюоресцеинизотиоцианата составляло 1:2:1, смесь инкубируют в течение 30-S0 мин, после чего выделяют целевой продукт с помощью тонкослойной хроматографии, Пример 1, Получение флюоресцентно меченого норадреналина, 0,,1 ммоль норадреналина битартрата растворяют в 1 мл боратного буфера рН 9,0. К этому раствору добавля3 13056 ют 0,2 ммоль триэтиламина и 0,1 ммоль флюоресцеинизотиоцианата. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и наносят на хроматографическую пластину 5

Kieselge1, Разделение смеси осуществляют восходящей хроматографией в системе метанол-уксусная кислота

100:1. Полосу на хроматограмме, ха— рактерную для флюоресцентно меченого 10 норадреналина, после высушивания пластины вырезают. Элюирование флюоресцентно меченого норадреналина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой до рН 2,0, Выход флюоресцентно меченого норадреналина составляет

26, 37., Пример 2. Получение флюоресцентно меченого адреналина, 20

0,12 ммоль адреналина гидрохлорида растворяют в 1 мл боратного буфера рН !0,0. К этому раствору добавляют 0,24 ммоль триэтиламина и

0,12 ммоль флюоресцеинизотиоцианата.

Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 40 мин и наносят на хроматографическую пластину Kieselgel, Разделение смеси осуществляют восходящей хроматографией в системе метанол-уксусная кислота

100:1. Полосу на хроматограмме„ характерную для флюоресцентно меченого адреналина, после -высушивания пластины вь1резают. Элюирование флюо- 35 ресцентно меченого адреналина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой до рН 2,0. Выход флюоресцентно меченого адреналина составляет 27,0 . 0

Пример 3, Получение флюоресцентно меченого дофамина.

0,15 ммоль дофамина гидрохлорида растворяют в 1 мл боратного буфера рН 9,5. К этому раствору добавляют

0,3 ммоль триэтиламина и 0,15 ммоль флюоресцеинизотиоцианата. Полученную

03 4 смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 50 мин и наносят на хроматографическую пластину Kieselgel, Разделение смеси осуществляют восхОдящей хроматографией в системе метанол-уксусная кислота !00: 1.

Полосу на хроматограмме, характерную для флюоресцентно меченого дофамина, после высушивания пластины вырезают.

Элюирование флюоресцентно меченого дофамина с носителя осуществляют дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой до рН 2,0, Выход флюоресцентно меченого дофамина составляет 25,87..

Формул а и з о б р е т е н и я

1, Способ определения катехоламинов в плазме крови путем обработки катехоламинов агентами, вызывающими химическую модификацию с последующим определением флюоресценции, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, получают антитела к определяемому катехоламину, смешивают их с исследуемой пробой плазмы, затем добавляют флюоресцентно меченый катехоламин, смесь инкубируют при 20-30 С в течение 40-60 мин, измеряют поляризацию флюоресценции при 516 нм и по ее значению определяют концентрацию катехоламина.

2. Способ получения флюоресцентно меченого катехоламина, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью получения флюоресцентно меченого катехоламина, растворяют катехоламин в обратном буфере с рН 9,0-10,0 до конечной концентрации 0,10-0,15 И, добавляют триэтиламин и флюоресцеинизотиоцианат в молярном соотношении

1:2:1, инкубируют при 20-30 С в течение 30-50 мин и выделяют целевой продукт тонкослойной хроматографией, 1305603

0,2

0,2

0,20

0,2 сг

0,76

0,79

О,Q

0lO

008

00б аоч

10,5

Составитель Н, Гуляева

Техред А. Кравчук

Редактор В,Петраш

Корректор M. (лароши Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5

Заказ 2249

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãîðoä, ул,Проектная, 4