Способ выращивания метанолокислящих бактерий

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение выхода биомассы. Ацидофильные метанолокисляющие бактерии выращивают совместно с дрожжами, при этом бактерии используют в качестве источника углерода метанол, а дрожжи продукты жизнедеятельности бактерий. Не использующие метанол и дрожжи в процессе роста образуют и выделяют в питательную среду факторы роста, в первую очередь пантотеновую кислоту, стимулирующие развитие ацидофильных метанолокисляющих бактерий, что позволяет вести процесс без добавления факторов роста. В качестве ацидофильных метанолокисляющих бактерий используют штаммы Acetobacter methylicum, A, methylovorans, methylobacter aciclophilus, дрожжей представители родов Candida и saccharomuces. Выращивание осуществляют периодическим или непрерывным способом при аэрировании среды, оптимальных рН 3,5 4,5 и температуре 30 34°С. В среду для выращивания дрожжи вводят в количестве 0,1 50% от общего числа клеток. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству белковой биомассы из метанола, и может быть использовано для выращивания бактерий на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода метанол. Целью изобретения является повышение выхода биомассы. Способ осуществляется следующим образом. Ацидофильные метанолокисляющие бактерии выращивают на питательной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода совместно с микроорганизмами, не использующими метанол, но способными расти за счет продуктов метаболизма метанольных бактерий и образовывать факторы, стимулирующие рост клеток ацидофильных метанолокисляющих бактерий. В питательную среду входят источник азота в виде аммиака или солей аммония, источники фосфора и других минеральных компонентов. Выращивание проводят периодическим или непрерывным способом при аэрации питательной среды воздухом, кислородом или смесью воздуха с кислородом при подходящих для ацидофильных метанолиспользующих бактерий значениях рН 2,0-6,0, предпочтительнее 3,5-4,5, и температуре 28-40^оС, предпочтительнее 30-34^оС. Ацидофильные бактерии развиваются за счет метанола, а другой компонент смешанной культуры за счет продуктов жизнедеятельности ацидофильных бактерий. При этом не использующие метанол микроорганизмы в процессе роста образуют и выделяют в питательную среду факторы, стимулирующие развитие ацидофильных метанолокисляющих бактерий, что позволяет вести процесс без добавки факторов роста. Выделение факторов роста в среду доказывается тем, что культуральная жидкость после выращивания не использующих метанол микроорганизмов, добавленная в питательную среду, может обеспечить рост ацидофильных метанолокисляющих бактерий без факторов роста. Для совместного выращивания с ацидофильными метанолокисляющими бактериями производят отбор микроорганизмов, которые должны быть способными использовать углеродсодержащие продукты метаболизма ацидофильных бактерий, расти в тех же, что и ацидофильные метанолокисляющие бактерии, условиях (температура, рН, аэрация), способны потреблять такие же источники азота, фосфора и при этом образовывать необходимые ацидофильным бактериям факторы роста, в частности пантотеновую кислоту. К таким микроорганизмам относятся, например, некоторые виды дрожжей родов Candida и Saccharomyces, например, Candida sake, Candida maltosa, Saccharomyces cerevisiae. Метанолокисляющие бактерии и подобранные, не использующие метанол микроорганизмы, предварительно полученные раздельно обычными способами, предусмотренными для выращивания засевного материала, вносят в питательную среду одновременно. При этом количество засеваемых не окисляющих метанол микро- организмов может варьироваться в широких пределах, например, от 0,1 до 50% от общего числа клеток. В процессе совместного выращивания их содержание независимо от величины засева находится на уровне, определяемом количеством используемых продуктов метаболизма ацидофильных метанолокисляющих бактерий, так как на минеральной среде с метанолом эти продукты являются единственным доступным источником углерода для не использующего метанол компонента смешанной культуры. Такого небольшого количества не использующих метанол микроорганизмов достаточно, чтобы обеспечить рост ацидофильных бактерий без добавлений автолизата, в котором они нуждаются для своего развития. В результате такой саморегуляции содержания культур в процессе выращивания начальное соотношение клеток культур в засевном материале не имеет существенного значения, но рекомендуется вносить не окисляющих метанол микроорганизмов не менее 0,1% и не более 50% от общего числа клеток. Отклонение от этих значений в ту или иную сторону может привести в первом случае к задержке развития не окисляющих метанол дрожжей, а во втором к задержке роста ацидофильных метанолокисляющих бактерий. В таблице представлены данные по росту ацидофильных метанолокисляющих бактерий в чистой культуре и в смеси с подобранными не использующими метанол дрожжами различного систематического положения. Из таблицы видно, что все штаммы ацидофильных метанолокисляющих бактерий в чистой культуре нуждаются в факторах роста. Без добавки автолизата или пантотеновой кислоты рост или очень низкий, или вообще отсутствует. В смеси с подобранными не использующими метанол дрожжами культура растет без всяких добавок, и при этом выход биомассы на 20-40% выше, чем в чистой культуре с добавкой факторов роста. Таким образом, добавление к ацидофильным метанолокисляющим бактериям подобранных не использующих метанола дрожжей, растущих за счет продуктов метаболизма ацидофильных бактерий, может повысить выход биомассы на метаноле и исключить использование факторов роста. Добавление не окисляющих метанол дрожжей не влияет на качество биомассы, так как даже при введении в высокой концентрации дрожжей, не использующих метанол, их содержание в растущей культуре ограничивается количеством доступного источника углерода, которым являются продукты метаболизма ацидофильных метанолокисляющих бактерий, и обычно не превышает 1-10% от общего числа клеток. П р и м е р 1. Ацидофильный метанолокисляющий штамм бактерий Acetobacter methylicum БСБ-867 выращивают периодическим способом в колбах на качалке на питательной среде следующего состава: метанол 8,0 г/л; NH₄H₂PO₄ 2,0 г/л; W(NH₄)₂HPO₄ 0,5 г/л; MgSO₄ 0,2 г/л; K₂SO₄ 0,2 г/л; KI 0,01 мг/л; H₃BO₃ 0,01 мг/л; MnSO₄ x х 5H₂O 0,01 мг/л; (NH₄)₂MoO₄ 0,01 мг/л; FeSO₄х7H₂O 0,05 мг/л. Для обеспечения роста клеток в среду добавляют автолизат в количестве 0,1% Выращивание ведут при рН среды, равном 4,0, и температуре в пределах 30 ±1,0^оС. Через двое суток выращивания ацидофильных бактерий концентрация биомассы достигает 2,9 г/л, что принимают за 100% П р и м е р 2. Бактерии Acetobacter methylicum БСБ-867 выращивают таким же способом и в тех же условиях, что в примере 1, в смеси с дрожжами Candida sake БСБ-867, взятыми в количестве 0,1% но без добавки автолизата. Инокулятом служат бактерии с агаризованной минеральной средой с метанолом и дрожжи, выращенные на сусле-агаре. Содержание дрожжей в растущей культуре достигает 1% от общего числа клеток и затем не меняется в процессе выращивания. Через двое суток концентрация биомассы составляет 3,4 г/л, т.е. выход равен 117% по отношению к выходу биомассы при выращивании бактерий с добавкой автолизата. П р и м е р 3. Бактерии Acetobacter methylicum БСБ-867 выращивают таким же способом, в тех же условиях, что и в примере 1, без добавки автолизата, но в смеси с дрожжами Saccharomyces cerevisiae БСБ-879, взятыми в количестве 1% от общего числа клеток. После двух суток роста количество дрожжей не превышает 1% от общего числа клеток, и концентрация биомассы составляет 3,3 г/л, т. е. выход равен 114% по отношению к выходу биомассы при выращивании бактерий A. methylicum БСБ-867 с добавкой автолизата. П р и м е р 4. Бактерии A. methylicum БСБ-867 выращивают таким же способом, в тех же условиях, что и в примере 1, но без добавки автолизата в смеси с дрожжами C. maltosa БСБ-774, полученными с сусла-агара и вносимыми в количестве 50% от общего числа клеток. После двух суток роста количество клеток дрожжей не превышает 10% от общего числа клеток, и концентрация биомассы составляет 3,3 г/л, т.е. выход равен 114% по отношению к выходу биомассы при выращивании бактерий A. methylicum ВСБ-867 с добавкой автолизата. П р и м е р 5. Ацидофильный метанолокисляющий штамм бактерий Methylobacter acidophilus выращивают таким же способом и в тех же условиях, что и в примере 1, с добавлением автолизата в количестве 0,1% После двух суток роста концентрация биомассы составляет 2,3 г/л, что принимают за 100% П р и м е р 6. Ацидофильный метанолокисляющий штамм бактерий Methylobacter acidophilus выращивают таким же способом и в тех же условиях, что и в примере 1, без добавки автолизата, но в смеси с дрожжами C. maltosa БСБ-640, полученными с сусла-агара и вносимыми в количестве 10% от общего числа клеток. После двух суток роста количество клеток дрожжей не превышает 1% от общего числа клеток, и концентрация биомассы составляет 2,8 г/л, т.е. выход равен 121% по отношению к выходу биомассы при выращивании бактерий Methylobacter acidophilus с добавкой автолизата. П р и м е р 7. Штамм бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 выращивают в смеси с дрожжами Candida sake ВСБ-876, полученными на жидкой среде с глюкозой и вносимыми в количестве 5% от общего числа клеток, в ферментере объемом 13 л. В качестве источника углерода используют метанол, который подают в ферментер одновременно с солевым раствором в соотношении 1:0,7. Питательная среда для непрерывного процесса содержит 2,0 мас. метанола и соответствующее количество солей. Используют солевую среду следующего состава, г/л: KCl 48,0; MgSO₄ x 7H₂O 12,7; H₃PO₄ (70% ) 62,0; FeSO₄x7H₂O 3,4; ZnSO₄x7H₂O 2,3; MnSO₄x5H₂O 2,5; CuSO₄x5H₂O 0,28. Выращивание в ферментере ведут при перемешивании среды со скоростью 1200 об/мин, аэрации воздухом 0,5 л/л.мин, температурой 32±1,0^оС, поддерживая рН 4,0-402 аммиачной водой. Сначала проводят периодическое накопление. При достижении концентрации абсолютно сухой биомассы, равной 8,4 г/л, переходят на непрерывный процесс со скоростью разбавления D 0,18 ч^-1. После стабилизации непрерывного процесса устанавливается постоянная концентрация биомассы 8,4 г/л. При этом выход биомассы от количества метанола составляет 42,6% т.е. 115% по отношению к выходу биомассы при выращивании бактерий с добавкой автолизата. В биомассе содержится 74,5% общего белка и 5,0% золы. Дрожжевые клетки в биоценозе ферментера составляют 2,2% от общего числа клеток. В контроле при выращивании бактерий A. methylicum ВСБ-867 без внесения дрожжей, но с добавлением автолизата в количестве 0,1% выход автолизата выход биомассы от количества потребленного метанола составляет 37% что принимают за 100% П р и м е р 8. Штамм бактерий Methylobacter acidophilus выращивают в смеси с дрожжами Candida sake ВСБ-876, полученными на жидкой среде с глюкозой и вносимыми в количестве 10% от общего числа клеток, в ферментере объемом 2,4 л. В качестве источника углерода используют метанол, который подают в ферментер одновременно с солевым раствором. Концентрация метанола в растворе составляет 6 об. Используют солевую среду такого же состава и в том же соотношении, что и в примере 7. Выращивание в ферментере ведут при перемешивании среды со скоростью 1200 об/мин, аэрации воздухом 2 л/л.мин, температуре 32 ±1,0^оС, поддерживая рН 4,0-4,2 аммиачной водой. После периодического накопления при достижении концентрации биомассы 19,0 г/л переходят на непрерывный процесс со скоростью разбавления D 0,12 ч^-1. После стабилизации непрерывного процесса устанав- ливается постоянная концентрация, равная 19,2 г/л. При этом выход биомассы от количества метанола составляет 40,6% т.е. 116% по отношению к выходу биомассы при выращивании бактерий с добавкой автолизата. В биомассе содержится 73,1% общего белка и 5% золы. Дрожжевые клетки в биоценозе ферментера составляют не более 2% от общего числа клеток. В контроле при выращивании тех же бактерий без внесения дрожжей, но с добавлением автолизата в количестве 0,1% выход биомассы от количества метанола составляет 35% Таким образом, реализация предлагаемого изобретения обеспечивает возможность развития ацидофильных метанолокисляющих бактерий в отсутствие дополнительных факторов роста при одновременном повышении выхода биомассы на 15-20% Полученная биомасса ацидофильных бактерий содержит лишь незначительные примеси не использующих метанола дрожжей. Предлагаемый способ обеспечивает, кроме того, повышение экономической эффективности процесса выращивания микроорганизмов за счет упрощения состава питательной среды путем исключения добавок дополнительных факторов роста и за счет увеличения конверсии метанола в биомассу.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МЕТАНОЛОКИСЛЯЩИХ БАКТЕРИЙ, предусматривающий их совместное культивирование с другими не окисляющими метанола микроорганизмами, способными расти за счет продуктов метаболизма метанолокисляющих бактерий, на питательной среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, а также источника азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, при совместном культивировании из метанолокисляющих бактерий используют ацидофильные бактерии, а в качестве микроорганизмов дрожжи, способные образовывать в процессе культивирования пантотеновую кислоту, при этом последние используют в количестве 0,1 50% от общего числа клеток.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 14-2002

Извещение опубликовано: 20.05.2002        

---