Способ определения креатинкиназы мв в сыворотке крови

 

Изобретение относится к способу определения активности креатинфосфокиназы МБ (СК-МВ) в сыворотке. Цель изобретения - повышение точности определения креатинкиназы MB в сьшоротке крови. Для этого определяют СК-МВ иммунологическим исключением группы М и измерением группы В по известным методам для определения креатинкиназы . Исключают Группы М в реакционной смеси из антител против группы М, добавляют одновалентные фрагменты, полученные протеолитическим расщеплением при восстанавливающих условиях.Фрагменты тормозят не только природными антителами, которые принадлежат к IgG-фракции или к j-глобулинам и имеют молекулярную массу 130.000-210.000, но и FAB-фрагментами, образующимися в результате . протеолитического расщепления, из фракции IgG или -глобулина антисыворотки к креатинкиназе ММ, при этом их предварительно обрабатывают ацетамидом йода. 1 табл. (О СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2891744/28-14 (22) 29.02.80 (31) P 2908053.3 (32) 02.03.79 (33) DE (46) 07.09.87.Бюл. У 33 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Вольфганг Грубер, Хельмут Ленц, Зигфрид Лоозер и Ханс-Ральф Линке (0Е) (53) 615. 373 (088. 8) ..(56) ImmunochemIstry 1969,чо1.6, р.681-687. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНКИНАЗЫ МВ В СЬ1ВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к способу определения активности креатинфосфокиназы МВ (СК-МВ) в сыворотке. Цель изобретения — повьппение точности определения креатинкиназы МВ в сыво„„SU „„1336941 А 3 ротке крови. Для этого определяют

СК MB иммунологическим исключением группы М и измерением группы В по известным методам для определения креатинкиназы. Исключают группы М в реакционной смеси из антител против группы М, добавляют одновалентные фрагменты, полученные протеолитическим расщеплением при восстанавливающих условиях. Фрагменты тормозят не только природными антителами, которые принадлежат к IgG-фракции или к т-глобулинам и имеют молекулярную массу 130.000-210.000, но и FAB-фрагментами, образующимися в результате . протеолитического расщепления из фракции IgG или т-глобулина антисыворотки к креатинкиназе ММ, при этом их предварительно обрабатывают ацетамидом йода. 1 табл.

1 133

Изобретение относится к способу определения активности креатинфосфокиназы МВ, называемой СК-МВ, в сыворотке.

Целью изобретения является повышение точности определения креатинкиназы MB в сыворотке крови.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ определения .креатинкиназы

МВ в сыворотке осуществляется иммунологическим исключением группы M и измерением группы В по известным методам для определения креатинкиназы. Для исключения группы М в реакционной смеси из антител против группы М добавляют одновалентные фрагменты, полученные протеолитическим расщеплением при восстанавливающих условиях.

Ферменты тормозятся не только природными антителами, которые принадлежат к IgG-фракции или к -глобулинам и имеют молекулярную массу около

130.000-210.000, но и ГАВ-фрагментами, образующимися в результате протеолитического расщепления.

Пример 1. Получение lgG-фракЦиие

Сыворотка овец, которые подвергнуты иммунизации СК-ММ (мышечный тип фермента ) человека, смешивают с кристаллическим сульфатом аммония при

0-4 С и рН М. После центрифугирования осадок растворяют в

0,1 M TPIS/0,15 М МаС1 - буферном растворе, рН 8, и подвергают диализу относительно избыточного количества 10 MM фосфатного буферного раствора, рН 7,1. Еще раэ осветленный центрифугированием диализат наносят на колонку, которая заполнена ДЕАЕцеллюлозой. Содержащий протеины поток и элюат, который получается с

15 мМ фосфата /10 мМ йаС1 - буферного раствора, рН 7,1, соединяются и содержат более 957. чистой lgG.

Расщепление папаином.

IgG инкубируют при восстанавливающих условиях (10 мМ цистеина ) с

1,57 папаина (мас.7 в пересчете на количество IgG-протеина) при рН

7,5 свыше 5 ч при 37 С. В конце фазы инкубации воздействие фермента прекращается избытком ацетамида иода и для алкилирования свободных

SH-групп проводят 2 ч инкубацию при рН 7,5 при комнатной температуре.

694)

10 t5

Стабилизированная смесь расщепления содержит FAB-фрагменты, F -фрагменты и (107 нерасщепленной IgG Выход иммунореакционной способности составляет более 757.

Очистка ЕАВ-фрагментов.

После концентрации до 30 мг/мл ультрафильтрованием смесь расщепления разделяют методом гель-хроматографии. FAB-фрагменты элюируют как последний протеиновый пик, хорошо отделенный от IgG и Р, - фрагментов.

FAB-фракция после концентрирования ультрафильтрованием может применяться непосредственно для торможения

СК MM или СК MB (мозговой тип). Торможение СК-МВ (гибридный тип) составляет в рамках предела погрешности 507. Торможение СК-ММ составляет

99-1007..

Пример 2. Получение фракции -глобулина из плазмы овцы.

Цитратную плазму овец, которые подвергались иммунизации с СК-ММ в течение 4-6 месяцев, разбавляют

25 мМ хлористого кальция и ставят приблизительно на 2 ч при комнатной температуре для коагуляции. После механического дробления коагулята разбавляют 1 объемом физиологического NaCI-ðàñòâaðà и смешивают для адсорбции липопротеина с 27 силикатного коагулянта (аэрозил ).

Центрифугированием получается прозрачный верхний слой. Из верхнео го слоя при 0-4 С и при рН 7 осаждается при помощи 1,8 М сульфата аммония фракции -глобулина и собирает ся центрифугированием. Диализом относительно 50 мМ TP (S/0,1 М hlaCI буферного раствора, рН 7,5, и концентрацией ультрафильтрованием получают пригодный для расщепления ферментами препарат антител.

Расщепление папаином.

Работают по примеру 1, но проводится некоторая модификация для фракции т-глобулина. 1,57 папаина относятся в 1 r протеина фракции -глобулина, а время инкубации составляет 20 ч при 25 С. Остальные условия одинаковы.

Очистка ГАВ-фракции.

Алкилированная смесь расщепления подвергается диалиэу относительно физиологического раствора хлористого натрия, затем смешивается с 25 мМ сульфата цинка. В результате этого

1336941

Формула изобретения

Торможение ферментной активности, Ж

Животное

СК-ММ/600-1000 ед/л

СК-МВ/200-400 ед/л

FAB-фрагменты

Исходная FAB-фрагсыворотка менты (плазма ) Исходная сыворотка

99,5 99,5

99,6 99,7

52

53

49

99,1

99,3

99,3

98,5

Составитель Г.Крюкова

Редактор И.Шулла Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга

Заказ 4057/59 Тираж 594 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Ужгород, ул, Проектная, 4 осаждаются остатки нерасщепленных

1gG u F -фрагментов и отделяются центрифугированием. Остающиеся

FAB-фрагменты после диализа и кон5 центрации готовы для применения в

СК MB-тесте. Выход составляет более

80Х тормозящей активности для СКMM-изофермента в пересчете на исходную плазму. СК-МВ тормозится на 503 10 независимо от величины торможения для нерасщепленных антител.

В таблице показаны результаты, полученные с различными сыворотками.

Предлагаемый способпозволяет по сравнению сизвестным, в которомтормозят

СК-MM полностью и СК-MB на 60-907., получать одновалентные фрагменты (FAB-фрагменты), которые тормозят .СК-ММ, а СК-МВ тормозят в рамках 20 предела погрешности только до 50Х.

В результате становится возможным применять полученные от соответствующих подопытных животных(овцы, кролика, курицы и т.п.) антисыворотки 25 для определения СК-МВ, не выделяя предварительно связанными с затратами аналитическими методами тех антисывороток, которые тормозят СК-МВ приблизительно более чем на 537.

Возможно расщеплять сыворотки без предшествующего определения их тормозящих свойств протеолитическим путем при восстанавливающих условиях и исключать затем специфически с фрагментами расщепления группу М СК независимо от того, имеются ли в мышечном ферменте СК MM или в гибридном ферменте СК-МВ.

Способ определения креатинкиназы

МВ в сыворотке крови путем обработки ее антителами к креатинкиназе ММ, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве антител используют одновалентные фрагменты F-AB, выделяемые из фракции 1gG или -глобулина антисыворотки к креатинкинаэе

ММ, при этом их предварительно обрабатывают ацетамидом йода.