Способ иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов

 

Изобретение относится к клини- .ческой иммунологии. Для повышения. чувствительности способа к последовательным разведениям исследуемой сыворотки крови добавляют эритроцитарный диагностикум, полученный сенсибилизацией эритроцитов агрегированными белками иммунной сыворотки кролика . Для сенсибилизации используют агрегированную гамма-фракцию иммунной сыворотки. Вьщеленную гамма-фракцию перед агрегацией глутаральдегидом подвергают диализу против дистиллированной воды, физиологического раствора и разводят им в объемном соотношении 1:1-1:2. Глутаризированные эритроциты сенсибилизируют J -глобулином в течение 1-2 ч при 37-56 С, добавляют их к исследуемой крови и при наличии гемагглютинации в титре 1:64 и более диагностируют заболевание. с (Л 00 со ел 00 -sj

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС ГВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3874178/28-14 (22) 10.04.85 (46) 07.09.87, Бюл. У 33 (71) Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (72) И.Н. Ильина (53) 615.373(088.8) (56) Luther P., Bergmann К.-Ch,, Erkrank Z, Atm. 0rg. 1977, 150, р. 43-50. (54) СПОСОБ ИИИУНОЛОП1ЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭКЗОГЕННОГО АЛЛЕРГИЧЕСКОГО

АЛЬВЕОЛИТА ПТИЦЕВОДОВ (57) Изобретение относится к клини.ческой иммунологии. Для повышения. чувствительности способа к последовательным разведениям исследуемой сы„„SU„„1 5 77 А1 (5Н 4 G 01 N 33/48 А 61 К 39/00 воротки крови добавляют эритроцитарный диагностикум, полученный сенсибилизацией эритроцитов агрегированными белками иммунной сыворотки кролика. Для сенсибилизации используют агрегированную гамма-фракцию иммунной сыворотки. Выделенную гамма-фракцию перед агрегацией глутаральдегидом подвергают диализу против дистиллированной воды, физиологического раствора и разводят им в объемном соотношении 1:1-1:2. Глутаризированные эритроциты сенсибилизируют 1" -глобулином о в течение 1-2 ч при 37-56 С, добавляют их к исследуемой крови и при наличии гемагглютинации в титре 1:64 и а более диагностируют заболевание.

5877

55

133

Изобретение относится к клинической иммунологии.

Цель изобретения — повьш ение чувствительности способа, обеспечивающее увеличение эффективности иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов, Предлагаемый способ иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов осуществляется путем выявления циркулирующих специфических птичьих актигенов (протеинов сыворотки кур) при добавлении к последовательным разведениям исследуемой сыворотки крови больного эритроцитарного диагностикума, полученного сенсибилизацией эритроцитов агрегированными белками иммунной сыворотки кролика, Для сенсибилизации используют агрегированную гамма-фракцию иммунной сыворотки, содержащую основную массу иммунологически активных белков-антител. Выделенную гамма-фракцию перед ее агрегацией глютаральдегидом подвергают диализу против дистиллированной воды, физиологического раствора и разводят им в оптимальном соотношении 1:1 — 1:2 по объему.

Глутаризированные эритроциты сенбилизируют гамма-глобулином в течео ние 1-2 ч при 37-56 С, По агглюти. нации полученного эритроцитарного диагностикума в разведении исследуемой сыворотки больного 1:64 и выше диагностируют заболевание экзогенным аллергическим альвеолитом, Пример 1. Обработку эритроцитов человека (0(1) гр, Rh ) глютаральдегидом с целью их стабилизации и активации проводят по методу Л.Г,Гориной. Эритроциты человека 0(1) — и группы, резус-отрицательные многократно отмывают физиологическим раствором хлористого натрия до отсутствия реакции на белок с 50%-ной трихлоруксусной кислотой в надосадочной жидкости, К осадку отмытых эритроцитов добавляют двукратный объем нейтрального физиологического раствора и глютаральдегид до конечной концентрации

0,25%, Обработку глютаральдегидом о проводят при 37 С в течение 3 ч пери одически перемешивая эритроцитарную взвесь. Отмывают эритроциты 4 раза нейтральным (рН 7,0) физиологическим раствором, ресуспекдируют им же осадок эритроцитов до 8%-ной концентрации, добавляют глютаральдегид до

0,25%-ной конечной концентрации и . мертиолат в соотношении 1:10000. Обработанные таким образом эритроциты стабилизированы, активированы и могут быть использованы при хранении при а

4 С в течение 6 мес °

Пример 2. Получают иммунную

10 сыворотку путем иммунизации кроликов антигенным препаратом — куриной сывороткой. Схема иммунизации известна и состоит из 3 инъекций антигена: 1-я иммунизаций — введение антигена в пол15 ном адъюванте Фрейнда непосредственно в лимфоузел; 2 и 3-я иммунизации— внутривенное- введение антигена соответственно через 28 и ЗО дн, после

1-й иммунизации. Иммукизирующие дозы

2п рассчитывают, исходя из концентрации общего белка в антигекном препарате (40 мг/мл), Цля первой иммунизации доза актигека по белку составляет 5 мг на кролика. Концентрация белка при

25 реиммунизации (для каждой инъекции) составляет 20 мг. Кровь забирают тотально через 7-10 дн. после послецней реиммунизации:, Титр иммунных сывороток в реакции диффузионной преципитаЗО ции в пределах 1:37 — 1:64„

Пример 3. Выделение гаммаглобулина из иммунной сыворотки проводят двукратным осаждением сернокислым аммонием до 40%-ного насыщения, 35

Полученную гамма-фракцию иммунной сыворотки диализуют в течение суток

IIp0THB дистиллированной воды, а. затем — против физиологического раствора хлористого натрия. Полученный таким образом гамма-глобулин разливают небольшими объемами (1-2 мл) и до использования хранят при -20 С.

Пример 4. Подбор агрегирующей дозы глютаральцегида для иммунной сыворотки осуществляют следующим образом, К пробам, содержащим по 1 мл разведенного в 2 раза препарата IaMма-глобулина иммунной сыворотки (соотношение 1:2), добавляют в возрастающих дозах 2,5%-ный глютаральдегид (0,02; 0,03; 0,05; 0,0Т; 0,09 и 0,1мл), инкубируют 1 ч при 37 С и оценивают эффект агрегации визуально. Проба с правильно выбранной дозой глютаральдегида не опалесцирует, слегка вязкая,, но свободно растекается. Для большинства полученных препаратов агрегирующая доза глютаральдегида составляет

0,02-0,05 мл. з

1335877

Способ осуществляют следующим обПример 5. Способ осуществляют по примеру 4, но применяют разведение гаммаглсбулина 1: 1 и сенсибилизируют эритроциты при 37 С. Количество выявленных больных в исследованной группе составило 777.

Таким образом, в результате осуществления способа чувствительность диагностики возросла на 317. Следовательно, эффективность предлагаемого способа при диагностике экзогенного аллергического альвеолита птицеводов значительно выше, чем известного способа. Ни одна из исследованных сывороток с негативным результатом в предлагаемом споссбе не была позитивной и в известном способе. Предлагаемый способ дает возможность выявления антигена — ипдуктора заболевания, верификации клинического диагноза и в случаях, когда результаты других иммунологических способов (выявления специфических антител) отрипательны. Применение предлагаемого способа имеет также большое значение для динами еского наблюдения за контингентом лиц с профессиональным .риском заболевания экзогенным аллергическим альвеолитом.

Кроме того, предлагаемый способ имеет высокую производительность.За рабочий день можно проьести исследование 80-100 сывороток крови. Это позволяет использовать способ в качестве рутинного теста при массовых ( клинико-иммунологических обследованиях больших контингентов лиц, профессионально контактирующих с этиологическими факторами экзогенных аллергических альвеолитов, Формул а изобретения ки экзогенного аллергического альвеолита птицеводов путе исследования крови, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, перед исследованием крови из антисыворотки против белков куриной сыворотки выделяют гамма-глобулиновую фракцию, диализуют ее последовательно против дистиллированной воды и физиологического раствора,разводят последним в соотношении 1:1

1:2 по объему, обрабатывают глутаровым альдегидом и сенсибилизируют глу— разом °

1 мл обработанных глютаральдегидом эритроцитов отмывают 4 раза при

2000 об./мин 0,9Z-ным раствором, до5 бавляют к осадку отмытых эритроцитов

1 мл предварительно агрегированного гамма-глобулина иммунной сыворотки и

20 мг биокарбоната натрия, Сенсибили- 10 зацию эритроцитов проводят при 56 С в водяной бане в течение 1,5 ч, Отмывают сенсибилизированные эритроциты

4 раза физиологическим раствором хлористого натрия. Ресуспендируют сенси- 15 билизированные эритроциты до 0,87-ной концентрации и используют в качестве диагностикума, добавляют по 1 капле препарата (объем 0,025 мл) к каждому разведению исслепуемых сывороток (в объеме 0,05 мл), Исследуемые сыворотки предварительно для удаления гетерогемагглютининов адсорбируют эритроцитами, обработанными глютарапьдегидом, но не 25 сенсибилизированными. При осуществлении способа проводят несколько контролей.

Эритроциты, не нагруженные антигеном, добавляют к исследуемой сыворотке в начальном разведении (контроль сыворотки на отсутствие гетерогемагглютининов). Сенсибилизированные гамма-глобулином иммунной сыворотки (антителами) эритроциты добавляют к физиологическому раствору (контроль

35 диагностикума на наличие спонтанной гемагглютинации). Сенсибилизированные эритроциты добавляют к антигенному препарату (куриной сыворотке) в разведениях (контроль реакции), Учет реакции проводят через 2 ч инкубации при комнатной температуре, считая положительной реакцию только в разведениях сыворотки, дающих выраженную агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов. Необходимыми условиями учета реакции являются отрицательные контроли сыворотки и диагностикума, а также положительный конт- 50 роль реакции.

Исследованные полученным диагностикумом сыворотки больных в 777 случаев давали реакции в титре 1:64 и выше, тогда как сыворотки здоровых доноров давали реакцию не выше 1:32.

По известному способу в исследованной группе определено 46Х больных.

Способ иммунологической диагностиСоставитель Л. Падюков

Техред В.Кадар

Редактор П. Герешй

Корректор,И. Муска

Заказ 4042/38 Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 э 1335877 6 таризированные эритроциты в течение гйммаглютинации в титре 1:64 и более ,1-2 ч при 37-56 С, далее добавляют ик диагностируют аллергический альвео к исследуемой крови и при наличии олит,